基于16S rRNA高通量測序評價患病草魚體表及肝臟細菌多樣性

孫 坤，王曉磊，張 潔，付龍威，劉學美，張艷珍，隋智海，劉云國

( 1.臨沂大學 生命科學學院，山東 臨沂 276000； 2.臨沂大學 教育學院，山東 臨沂 276000； 3.新疆大學 生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊 830046； 4.臨沂市河東區(qū)農(nóng)業(yè)技術推廣站，山東 臨沂 276003 )

草魚(Ctenopharyngodonidellus)屬鯉形目、雅羅魚亞科、草魚屬，是一種典型的草食性淡水魚類[1]。草魚因具有生長快、易飼養(yǎng)、品質好等優(yōu)良特性，已成為中國乃至世界上產(chǎn)量最大的淡水養(yǎng)殖魚類之一[2]。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大及養(yǎng)殖環(huán)境的逐步惡化，病原微生物感染頻發(fā)，導致草魚肌肉品質下降，口味變差，甚至引發(fā)大規(guī)模死亡，造成嚴重的經(jīng)濟損失[3]。草魚養(yǎng)殖中常見的細菌感染性疾病有爛鰓病、細菌性敗血癥、腸炎病、赤皮病等，往往發(fā)病急、死亡率高[4-5]。爛鰓病主要是由柱狀黃桿菌(Flavobacteriumcolumnare)引起，可導致草魚爛鰓、體表潰瘍等癥狀[6]。氣單胞菌屬(Aeromonas)可引發(fā)草魚等淡水養(yǎng)殖魚類的細菌性敗血癥、腸炎病[7-8]。目前，草魚養(yǎng)殖中細菌感染的控制和預防主要是依賴抗生素和疫苗，如滅活嗜水氣單胞菌疫苗等[9]，但這些方法并不能完全避免病害暴發(fā)。

為實現(xiàn)魚類細菌性疾病的精準防治，快速診斷并鑒定病原細菌、把握防治關鍵時機至關重要[10]。傳統(tǒng)病原菌鑒定方法主要是基于分離—培養(yǎng)—分析的手段，如常規(guī)16S rRNA PCR鑒定、形態(tài)學分析、生理生化特性分析、耐藥性分析等[11]。通過傳統(tǒng)方法目前已成功分離并鑒定出很多致病菌，如李楠等[12]從瀕死草魚的內(nèi)臟中分離并鑒定出3株病原細菌——霍亂弧菌(Vibriocholerae)、嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)和柱狀黃桿菌，并測定其毒力和耐藥性；胡錢東等[13]首次報道類志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigeloid)是草魚肌肉糜爛病的致病菌；張飄等[14]在貴州岑鞏縣某養(yǎng)殖場發(fā)病草魚體內(nèi)分離到1株維氏氣單胞菌(A.veronii)GZQG2019。但由于有些病原微生物不能培養(yǎng)，或培養(yǎng)條件苛刻，或因豐度低難以分離，傳統(tǒng)方法在病原微生物多樣性檢測中具有局限性，且分離培養(yǎng)法也比較耗時，不利于及時把握、控制傳染的關鍵時機[15]。

16S rRNA高通量測序是一種快捷有效的微生物檢測方法，可全面評價微生物多樣性，能彌補傳統(tǒng)方法的缺陷[16]。周本翔等[17]采用16S rRNA高通量測序技術發(fā)現(xiàn)，食物改變會顯著影響草魚腸道真菌物種組成。朱文根等[18]利用16S rRNA高通量測序技術研究發(fā)現(xiàn)，草魚呼腸孤病毒感染可使草魚腸道微生態(tài)發(fā)生紊亂。曾學琴等[19]用高通量測序法比較患乳房炎奶牛和正常奶牛的乳頭擦拭子和牛奶中細菌的多樣性，闡述了奶牛乳房炎關聯(lián)微生物。

筆者選取2個不同養(yǎng)殖池中患病草魚的潰爛皮膚和肝臟作為試驗對象，基于Illumina MiSeqTM高通量測序技術和生物信息學分析研究患病草魚皮膚和肝臟的細菌群落組成和多樣性，推測引發(fā)此次疾病的優(yōu)勢病原細菌，為病害的精準控制提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品來源與采集

2020年4月，山東省臨沂市蒙陰縣某草魚養(yǎng)殖場暴發(fā)疾病，造成草魚大量死亡。草魚發(fā)病癥狀為：體表鱗片有脫落，臀鰭基部充血發(fā)紅及其周圍皮膚潰爛，肛門紅腫，肝臟腫大、呈灰白色。從2個養(yǎng)殖池中分別隨機選取3尾瀕臨死亡、體質量相當?shù)幕疾〔蒴~，用75%乙醇擦拭魚體表面，用無菌采樣袋密封后，置于冰盒中運往實驗室。

在無菌條件下，分別取同一養(yǎng)殖池的3尾患病草魚的臀鰭基部周圍潰爛皮膚及其肌肉組織，混勻后，分別編號為1號池—皮膚(1-1)和2號池—皮膚(2-1)；沿著肛門處將其解剖，剪取同一養(yǎng)殖池的3尾草魚的部分肝臟，混勻后，分別編號為1號池—肝臟(1-2)和2號池—肝臟(2-2)，對上述4個樣品立即進行DNA提取。

1.2 DNA提取與濃度測定

參照GeneJET Genomic DNA Purification Kit試劑盒說明書，對4份樣品(約30 mg)進行研磨并提取基因組DNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，用Nanodrop儀器測定DNA的濃度，以確保所提取DNA質量滿足后續(xù)擴增要求。提取的基因組DNA保存在-20 ℃。

1.3 16S rRNA基因擴增和測序

16S rRNA基因擴增和測序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。針對16S rRNA基因的V4區(qū)域進行PCR擴增，設計帶Barcode的特異引物515F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′；806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。PCR擴增采用Phusion Flash high-fidelity PCR Master mix試劑盒，反應條件為：94 ℃預變性30 s；94 ℃變性30 s，50 ℃退火55 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸15 min。瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物，利用Qubit 3.0 DNA檢測試劑盒測定回收的DNA濃度，以便按照1∶1等量混合后測序。等量混合時，每個樣品DNA量取10 ng，最后使用Illumina MiseqTM進行上機測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

IlluminaMiseqTM測序獲得原始序列(Raw data)，利用Cutadapt、PEAR和Prinseq軟件去除引物接頭、拼接和去除低質量序列，得到有效序列(Clean data)。對有效序列完成運算分類單位(OTU)聚類、α多樣性、β多樣性和群落結構組成等分析[17-18]。

2 結果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)和聚類分析

提取2個不同養(yǎng)殖池的患病草魚的臀鰭基部潰爛皮膚組織和肝臟DNA，擴增16S rRNA基因的V4區(qū)，基于Illumina MiSeqTM高通量測序檢測體表和肝臟的細菌多樣性，將原始數(shù)據(jù)過濾并統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)4個樣本共得到原始序列186 963條，通過去除嵌合體及非特異性擴增序列后，得到有效序列共183 574條，平均測序讀長為251.37 bp，每個樣品有效序列占原始序列的比例均在96%以上(表1)。

表1 16S rRNA高通量測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計Tab.1 Statistics of the high-throughput 16S rRNA sequencing data

在97%相似度的標準下，對測序序列進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)1號池—皮膚和肝臟(1-1和1-2)的運算分類單元數(shù)分別為611個和875個，2號池—皮膚和肝臟(2-1和2-2)的運算分類單元數(shù)分別為376個和644個，其中4組樣本所共有的運算分類單元數(shù)為87個，分別占總運算分類單元數(shù)的14.32%、9.94%、23.14%和13.51%；4組樣品所特有的運算分類單元數(shù)目分別為342、584、209和384個(圖1)。

圖1 運算分類單元分布韋恩圖Fig.1 Venn diagram showing the distribution of OTU

2.2 稀釋曲線

稀釋曲線可評價測序量是否足以覆蓋所有物種類群，并間接反映物種的豐富程度。由稀釋曲線(圖2)可見，隨機抽取測序條數(shù)在30 000條以下時，隨著測序條數(shù)增加，4個樣品的運算分類單元數(shù)急劇上升；在30 000～50 000條，隨著測序條數(shù)增加，4個樣品雖然會有新的運算分類單元出現(xiàn)，但是曲線趨于平緩，表明該樣品測序量合理，可真實反映出細菌群落結構和多樣性。

圖2 稀釋曲線Fig.2 The dilution curve of samples

2.3 微生物多樣性

2.3.1 α多樣性

試驗中所得到的患病草魚皮膚和肝臟樣品α多樣性指數(shù)見表2。每個樣品的覆蓋率均達到99.4%以上，表明測序結果可靠，樣品中的序列幾乎全被檢測出且達到飽和狀態(tài)，可充分反映樣品的細菌多樣性。通過比較這4個樣品各項的α多樣性指數(shù)，發(fā)現(xiàn)1號池—肝臟(1-2)的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)最大，分別高達1375.109和1208.399，表明1號池的患病草魚肝臟樣品菌群豐度最大；1號池—肝臟(1-2)的Shannon指數(shù)最大，為3.298，Simpson指數(shù)最小，為0.24369，表明1號池的患病草魚肝臟樣品細菌群落多樣性最高。此外，2個養(yǎng)殖池的患病草魚微生物豐度和多樣性肝臟(1-2和2-2)均比皮膚(1-1和2-1)高。

表2 樣品細菌豐富度和多樣性指數(shù)Tab.2 The bacterial abundance and diversity index of samples

2.3.2 β多樣性

樣品間微生物群落結構差異可通過β多樣性來分析。基于運算分類單元進行主坐標分析得到不同樣品的β多樣性的主坐標分析(PCoA)(圖3)：第1主坐標和第2主坐標的貢獻率分別為91%和9%；1號池—皮膚(1-1)、2號池—皮膚(2-1)和2號池—肝臟(2-2)這3個樣品聚集在一起，距離較近，

圖3 基于樣品運算分類單元的主坐標分析Fig.3 PCoA analysis of sample OTUS

這表明這3個樣品菌群結構較為相似；而1號池—肝臟樣品(1-2)單獨分布，距離其他3個樣品距離較遠，說明該樣品與另外3個樣品的菌群結構差異較大。

根據(jù)對不同樣品進行聚類分析研究其微生物群落多樣性差異，利用非加權組平均法(UPGMA)算法構建樹狀結構，再根據(jù)樣本間Unifrac距離矩

陣繪制熱圖(圖4，顏色塊代表距離值，顏色越紅表示樣本間距離越近，相似度越高，越藍則距離越遠)：1號池—皮膚(1-1)、2號池—皮膚(2-1)及2號池—肝臟(2-2)這3個樣品距離很近；1號池—肝臟(1-2)則與其他3個樣品距離較遠。

圖4 基于Unifrac距離的熱圖Fig.4 Heatmap based on Unifrac distance

2.3.3 細菌群落結構

在門水平上，4組樣品占優(yōu)勢的主要以擬桿菌門和變形桿菌門為主，但門的豐度有所差別，1號池—皮膚(1-1)、2號池—皮膚(2-1)和2號池—肝臟(2-2)均以擬桿菌門豐度最高，分別占84.78%、97.18%和87.37%，而1號池—肝臟(1-2)以變形桿菌門豐度最高，占80.02%(圖5)。

圖5 門水平上各樣品中細菌群落的相對豐度和組成Fig.5 Relative abundance and composition of bacteria from different samples at the level of phylum

在屬水平上，4個樣品主要菌群豐度差異較大(圖6)。1號池—皮膚(1-1)主要以黃桿菌屬(Flavobacterium，83.38%)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas，1.63%)為主；1號池—肝臟(1-2)主要以希瓦氏菌屬(Shewanella，49.39%)、鞘氨醇單胞菌屬(4.39%)、不粘柄菌屬(Asticcacaulis，2.07%)、黃桿菌屬(2.05%)為主；2號池—皮膚(2-1)主要以黃桿菌屬(96.93%)為主；2號池—肝臟(2-2)主要以黃桿菌屬(86.88%)、耶爾森氏菌屬(Yersinia，4.66%)為主。

圖6 屬水平上各樣品中細菌群落的相對豐度和組成Fig.6 Relative abundance and composition of bacteria from different samples at the level of genus

3 討 論

草魚作為我國四大家魚之一，是重要的淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟魚。隨著養(yǎng)殖規(guī)模擴大及部分養(yǎng)殖環(huán)境惡化，草魚病害頻發(fā)導致死亡，造成嚴重的經(jīng)濟損失[20]。因此，探索并診斷誘發(fā)病害的主要病原菌，了解其生物學特性，可為魚類健康養(yǎng)殖及早期病害防治提供科學依據(jù)。

3.1 16S rRNA高通量測序技術的應用

傳統(tǒng)方法是基于細菌分離培養(yǎng)法，通過形態(tài)特征、生理生化反應、16S rRNA基因序列測定與系統(tǒng)發(fā)育樹分析鑒定魚類病害的主要病原細菌，如鄒升等[21]從湖南環(huán)洞庭湖區(qū)精養(yǎng)魚池患病草魚腸道中分離出氣單胞菌、類志賀鄰單胞菌和格氏乳球菌(Lactococusgarvieae)。但是這種方法比較耗時，且有些細菌不可培養(yǎng)，極大地限制了對病原細菌的認識和了解。

高通量測序技術是新型病原檢測手段，具有快速、精準、陽性率高等特點，非常適合病原體診斷[22]。如任迪等[23]利用宏基因組高通量測序法顯著提高了膿毒癥患者血樣本中的病原體檢出率，縮短了檢出時間；涂飛云等[24]利用16S rRNA高通量測序技術分析豪豬膿腫膿汁細菌多樣性，為病原分離鑒定提供優(yōu)勢菌群的參考。

3.2 患病草魚皮膚和肝臟的細菌多樣性分析

本試驗針對山東省臨沂市蒙陰縣某草魚養(yǎng)殖場2個暴發(fā)病害的不同草魚養(yǎng)殖池(1號池和2號池)，利用16S rRNA高通量測序法分析患病草魚的潰爛皮膚組織和肝臟的細菌多樣性，快速診斷引發(fā)病害的病原細菌，為后期病害防治提供科學依據(jù)和參考。

16S rRNA高通量測序結果顯示，總體上，1號池草魚的皮膚和肝臟的運算分類單元數(shù)均比2號池草魚皮膚和肝臟的運算分類單元數(shù)多，說明1號池內(nèi)細菌感染情況較2號池復雜；α多樣性分析結果顯示，同一池內(nèi)病魚肝臟中微生物豐度和多樣性較皮膚高，其中1號池—肝臟的菌群豐度和多樣性最高，同樣提示1號池內(nèi)細菌感染情況較2號池復雜；β多樣性分析結果顯示，1號池—皮膚、2號池—皮膚和2號池—肝臟細菌群落結構相似，但1號池—肝臟細菌群落結構與其他3個樣品存在差異，這表明1號池在與2號池暴發(fā)相同病原菌感染的同時，其內(nèi)部可能并發(fā)了其他病原菌的感染，需要著重加以防治以免造成更大損失。曾有研究者發(fā)現(xiàn)，水溫高、有機物含量高等會加強黃桿菌的黏附和侵染能力[25]，因此推測2個養(yǎng)殖池的菌群結構差異可能與水溫、水質等因素有關。

3.3 患病草魚皮膚和肝臟的菌群結構分析

2個養(yǎng)殖池的草魚皮膚菌群結構在門水平上均以擬桿菌門為主，在屬水平上以黃桿菌屬為主，這與正常魚類體表細菌群落以變形桿菌門為主有所不同[26-29]。2號池—肝臟菌群結構與皮膚的相似，主要以擬桿菌門、黃桿菌屬為主。黃桿菌屬是一種機會病原菌，普遍存在于養(yǎng)殖水環(huán)境或泥土中，在健康魚的外表能形成生物膜，抵抗黏膜免疫防御，進而感染多種野生和養(yǎng)殖淡水魚種，導致其出現(xiàn)爛鰓、體表潰瘍等癥狀[30-31]。

1號池—肝臟菌群結構中，同樣發(fā)現(xiàn)有黃桿菌屬(2.05%)，但以變形菌門、希瓦氏菌屬為主，與1號池—皮膚菌群結構不同，推測1號池在暴發(fā)黃桿菌屬病原菌感染的同時，并發(fā)希瓦氏菌屬感染。希瓦氏菌屬也是一種機會病原菌，廣泛存在于水環(huán)境中，可與黃桿菌屬共同感染魚類[32-33]。之所以1號池病魚的肝臟菌群結構與皮膚存在差異，可能與某些病原菌的組織特異性相關，如黃桿菌屬更趨向侵染皮膚黏膜系統(tǒng)[34]；也可能與部分病原菌如希瓦氏菌等會對其他細菌存在拮抗作用有關[35]。此外，黃桿菌屬和希瓦氏菌屬目前已在虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)、大西洋鮭(Salmosalar)、河鱸(Percafluviatilis)、銀大馬哈魚(Oncorhynchuskisutch)等中被分離鑒定，均能引發(fā)相應的魚類疾病[36-38]。因此，我們推測這次病害極有可能是由黃桿菌屬和希瓦氏菌屬聯(lián)合引發(fā)的，這需要進一步開展病原分離、鑒定以及接種感染試驗，確定引發(fā)此次病害的病原細菌。

4 結 論

通過16S rRNA高通量測序法比較分析了臨沂市某草魚養(yǎng)殖場的2個不同的養(yǎng)殖池中的患病草魚潰爛皮膚和肝臟的菌群多樣性和結構組成，結果顯示，1號池草魚感染情況較2號池復雜；患病草魚潰爛皮膚和肝臟菌群結構主要以擬桿菌門和變形桿菌門為優(yōu)勢菌門，以黃桿菌屬和希瓦氏菌屬為優(yōu)勢菌屬，推測其是引發(fā)本次草魚病害的優(yōu)勢病原細菌。該試驗結果可為針對性防治該養(yǎng)殖場草魚病害提供科學依據(jù)和參考。