PI3K/Akt-FoxO1信號通路在煙草煙霧暴露下單核細胞炎性反應(yīng)中的作用及機制

孫雪皎，陳 琳，陳 慧，黃 尤，劉瓊霞，寧 宇

(柳州市人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，廣西 柳州 545006)

磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)屬于胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶之一，是生命活動中最為重要的信號通路之一，不僅與v．sre和v．ras等癌基因的產(chǎn)物相關(guān)，而且PI3K本身具有絲氨酸/蘇氨酸激酶的活性，故同樣具有磷脂酰肌醇激酶的活性[1]。PI3K分為3類，目前研究熱點主要是Ⅰ類，由一個調(diào)節(jié)亞基和一個催化亞基組成，對生物細胞的分裂，分化和凋亡等有著密切的聯(lián)系，并與癌細胞的生成和轉(zhuǎn)移有一定聯(lián)系[2]。LY294002是第一個人工合成的PI3Kα/δ/β的抑制劑，不僅能夠抑制自噬體的形成，而且還能夠使Akt/PKB失活，抑制細胞增殖和誘導(dǎo)細胞凋亡[3-4]。慢性阻塞性肺疾病(COPD)是臨床常見的氣道不完全可逆性氣流受限性疾病，研究指出患此疾病的最主要危險因素之一便是吸煙，有毒顆粒或氣體異常所引起的肺部炎性反應(yīng)也是造成COPD漸進性發(fā)展的主要原因[4-5]。為進一步了解COPD的炎性機制，研究并為該疾病的防治工作提供新的思路，本文通過應(yīng)用CSE刺激細胞以及PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002的干預(yù)，明確PI3K/Akt-FoxO1信號通路在煙草煙霧暴露下單核細胞細胞株炎性反應(yīng)中的重要作用及機制。

1 資料與方法

1.1實驗材料：選擇由中國科學院細胞庫所提供的人單核淋巴瘤細胞U937細胞為研究對象。

1.2方法：U937細胞加入到5～10 ml 10%胎牛血清的無菌塑料培養(yǎng)瓶，并置于37℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞，離心后進行培養(yǎng)基重懸，稀釋至1.5×104個/ml，并接種于6孔板，每孔加入細胞懸液2 ml，并分為三組：對照組；煙草煙霧提取物(CSE)組；PI3K抑制劑組。應(yīng)用Brdu法確定實驗中CSE的合適濃度，其中CSE的制備是將10支去濾嘴的香煙點燃后，用50 ml注射器對煙霧進行連續(xù)抽取，并輸入至10 ml PBS緩沖液中，密閉后搖晃瓶身即為CSE。PI3K抑制劑組的細胞給予LY294002預(yù)孵育2 h后給予CSE刺激過夜，之后給予TNF-α刺激過夜；CSE組不應(yīng)用LY294002，其余同抑制劑組；對照組患者僅給予腫瘤壞死因子(TNF)-α。

1.3觀察指標：應(yīng)用ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液中白細胞介素(IL)-8的水平，應(yīng)用Western印跡檢測PI3K/Akt通路關(guān)鍵蛋白Akt、p-Akt蛋白以及FoxO1及p-FoxO1蛋白的表達。

2 結(jié)果

2.1三組IL-8水平檢測結(jié)果比較：CSE組IL-8水平為(2.24±0.56)mmol/L,明顯高于PI3K抑制劑組的(1.70±0.43)mmol/L及對照組的(1.97±0.50)mmol/L，組間和組內(nèi)比較，差異具有統(tǒng)計學意義(F=3.072，P<0.05)。

2.2三組Akt、p-Akt蛋白以及FoxO1及p-FoxO1蛋白的表達水平比較:PI3K抑制劑組的p-Akt表達較CSE組減弱，但較對照組增強，p-FoxO1表達較CSE組增強，但較對照組減弱(P均<0.05)，Akt及FoxO1表達無明顯變化(P>0.05)。見表1。

表1 三組Akt、PAkt蛋白以及FoxO1及p-FoxO1蛋白的表達水平比較

3 討論

COPD已經(jīng)成為全球性衛(wèi)生問題，也是導(dǎo)致我國居民肺部疾病死亡的主要病因之一，國內(nèi)外相關(guān)研究均已證實煙草煙霧、空氣污染會導(dǎo)致肺組織內(nèi)環(huán)境出現(xiàn)氧化應(yīng)激，不僅造成氣道氧化損傷，使得氣道炎性反應(yīng)加劇，而且還會因此引起氣道重塑、氣流受限，并因此影響肺功能的正常表達[6]。COPD患者的炎性因子是引起慢性炎性反應(yīng)的主要因素，然而傳統(tǒng)糖皮質(zhì)激素對COPD患者肺泡巨噬細胞的炎性因子抑制效果幾乎無效，即糖皮質(zhì)激素抵抗作用，使得COPD患者的治療無法達到預(yù)期效果[7]，這在本研究中CSE組的IL-8水平明顯高于PI3K抑制劑組及對照組的結(jié)果中獲得了證實。因此尋求更為安全有效的信號傳導(dǎo)通路來進行炎性因子的抑制成為臨床研究的熱點。

LY294002 是一種廣譜 PI3K 抑制劑，抑制 PI3Kα,PI3Kδ 和 PI3Kβ ，也可抑制 CK2 的活性；同時是一種競爭性 DNA-PK 抑制劑，可逆結(jié)合 DNA-PK 的激酶結(jié)構(gòu)域；而且是一種自噬和凋亡激活劑[8]。本研究通過對U937細胞進行CSE建模并選擇PI3K抑制劑LY294002，其中的AKT是PI3K的主要效應(yīng)分子，在整個通路中負責信號傳導(dǎo)從而有效調(diào)控細胞的功能；而p-Akt是PI3K在活化狀態(tài)下產(chǎn)生3，4二磷酸磷脂酰肌醇和3，4，5三磷酸磷脂酰肌醇后，AKT與二磷酸磷脂酰肌醇反應(yīng)達到部分激活并在三磷酸磷脂酰肌醇協(xié)助下最終達到AKT的完全活化狀態(tài)，從而有效完成由細胞膜-細胞膜的生物信號傳遞作用[9]。Forkhead轉(zhuǎn)錄因子FOXO1調(diào)節(jié)涉及多種細胞功能基因的表達，包括凋亡、DNA修復(fù)、細胞周期的停滯和葡萄糖代謝等，AKT磷酸化FOXO1，抑制其核轉(zhuǎn)位而阻止其轉(zhuǎn)錄激活作用[10]。本研究顯示PI3K抑制劑組的PAkt表達較CSE組減弱，但較對照組增強，p-FoxO1表達較CSE組增強，但較對照組減弱；分析原因在于CSE組因煙草煙霧環(huán)境導(dǎo)致細胞的PI3K高表達和AKT活性增加，也因此引起了p-Akt的高表達；但當抑制組和CSE組共同應(yīng)用TNF-α后，由于LY294002的抑制效果能夠有效降低細胞的p-Akt表達水平，從而有效抑制IL-8水平；而對照組由于僅接受TNF-α刺激，缺乏煙草煙霧所形成的氧化應(yīng)激環(huán)境所造成[11-12]。

綜上所述，PI3K抑制劑LY294002可明顯減弱通路關(guān)鍵蛋白p-Akt的表達，增強p-FoxO1的表達，進而明顯減弱煙草煙霧暴露下單核細胞的炎性反應(yīng)。結(jié)果表明，PI3K/Akt信號通路活性及其下游FoxO1蛋白的表達與煙草煙霧暴露的單核細胞炎性反應(yīng)表達有關(guān)，以此為切入點，將為今后COPD的炎性反應(yīng)機制研究及防治工作提供新的思路。