LncRNA ROR 和TGF-β1 在乳腺癌患者中的表達及臨床意義

張玉娟 葉惠榮 袁惠玲 王永霞

廣東省東莞市人民醫院乳腺科，廣東東莞 523000

不同分子標記的乳腺癌亞型對治療的反應和預后均存在較大差異，如何早期診斷和預測預后是乳腺癌研究的熱點問題[1-2]。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，LncRNA）是長度大于200 個核苷酸的RNA 分子，具有結合靶基因啟動子區調控基因轉錄、介導染色質重構及結合mRNA 抑制翻譯過程等生物學作用[3-5]。LncRNA 參與包括癌變在內的多種疾病狀態，在肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等惡性腫瘤中異常表達，與惡性腫瘤發生發展密切相關[6-8]。長鏈非編碼RNA ROR（long noncoding RNA ROR，LncRNA ROR）是新近發現的LncRNA 分子，具有調節多能干細胞自我更新和分化的功能，子宮內膜癌、肝癌等多種腫瘤中發現LncRNA ROR 表達異常[9]。基礎研究顯示，LncRNA ROR/轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）途徑激活促進裸鼠乳腺癌細胞增殖和侵襲[10]。研究顯示，膀胱癌等腫瘤LncRNA ROR和TGF-β1 水平與血清表達均呈明顯正相關，血清LncRNA ROR 和TGF-β1 的價值逐漸引起臨床醫師重視，但血清LncRNA ROR 和TGF-β1 水平與乳腺癌病理特征及預后因素的相關性鮮見報道[11]。本研究通過分析乳腺癌和健康女性血清LncRNA ROR與TGF-β1水平，分析兩種標志物與乳腺癌病理特征的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018 年1 月至2019 年6 月在廣東省東莞市人民醫院（以下簡稱“我院”）經病理學確診的73 例乳腺癌患者作為研究組（A 組），其中中高分化47 例，低分化26 例；Ⅰ期24 例，Ⅱ期23 例，Ⅲ期26 例；淋巴結轉移37 例，無淋巴結轉移36 例；表型：人表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）陽性14 例，三陰性18 例，Luminal 41 例。納入標準：①經病理或組織學檢查確診為乳腺癌；②年齡≥20 歲，初次確診為乳腺癌，血清LncRNA ROR 和TGF-β1 檢查前未接受放療、化療、免疫治療等抗腫瘤治療；③患者對本研究知情并簽署知情同意書。排除標準：①合并嚴重心肝腎等功能不全；②合并其他部位原發性惡性腫瘤；③合并自身免疫性或急慢性傳染病；④妊娠或哺乳期婦女；⑤精神疾病或嚴重認知功能障礙。隨機抽取同期在我院就診的經病理證實的37 例乳腺良性病變（包括乳腺腺病21 例，乳腺纖維腺瘤8 例，乳腺導管內乳頭狀瘤8 例）為對照1 組（B 組），隨機抽取同期健康體檢的37 名健康受試者作為對照2 組（C 組）。A、B、C 組受試者一般資料比較，差異無統計學意義（P ＞0.05），具有可比性。見表1。

表1 三組一般資料比較

1.2 研究方法

受試者入組后抽取空腹靜脈血，采用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（real time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）法檢測血清LncRNA ROR 水平，首先采用Triol 法（試劑盒購自Biosharp 公司，貨號：20180911）提取血漿中總RNA，鑒別濃度和純度后，以1 μg RNA為模板反轉錄為互補DNA（complementary deoxyribonu cleic acid，cDNA），嚴格按照TaKaRa 反轉錄試劑盒（購自紅榮微再上海生物工程技術有限公司，貨號：20180821）說明實施。qRT-PCR 反應體系為cDNA 0.2 μl，2×SYBR 5 μl，ROXⅡ0.2 μl，正反向引物各0.5 μl，RNA-free 水3.6 μl，總反應體系體積10 μl。反應條件為95℃預變性5 min、95℃變性30 s、62℃退火30 s、70℃延伸30 s，共40 個循環。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內參，采用2-ΔΔCt法對檢測結果進行定量分析。ROR 的正向引物序列：5’-CTCCAGCTATGCAGACCACTC-3’，反向引物：5’-GTGACGCCTGACCTGTTGAC-3’；GAPDH 的正向引物序列：5’-AATGGACAACTGGTCGTGGAC-3’，反向引物：5’-CCCTCCAGGGGATCTGTTTG-3’。采用酶聯免疫吸附試驗檢測血清TGF-β1 水平，采用電化學發光法測定受試者腫瘤標志物水平，腫瘤標志物包括糖類抗原153（carbohy drate antigen 153，CA153）和癌胚抗原（carcinoembry onic antigen，CEA），試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號：20181016（TGF-β1）、20180721（CA153）和20181204（CEA），嚴格按照說明書操作，正常參考值范圍：CEA≤5 ng/L，CA153 ≤25 U/ml。

1.3 觀察指標

觀察三組受試者血清LncRNA ROR 和TGF-β1水平和LncRNA ROR與TGF-β1 診斷乳腺癌的臨床價值；觀察A 組年齡（≤50 歲、＞50 歲）、病理學分級（中、高分化，低分化）、臨床分期（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期）、淋巴結轉移（是、否）、表型（HER-2、三陰性、Luminal）等不同預后因素患者LncRNA ROR 和TGF-β1 水平的差別。

1.4 統計學方法

采用SPSS 23.0 軟件對所得數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t 法，計數資料采用例數或百分率表示，比較采用χ2檢驗。相關性分析采用Spearman 相關分析，采用受試者工作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC 曲線）計算LncRNA-ROR 和TGF-β1 預測乳腺癌的價值，曲線下面積（area under the curve，AUC）比較采用Z 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組受試者LncRNA ROR 和TGF-β1 水平比較

A 組LncRNA ROR 和TGF-β1 水平高于B 組和C 組，差異有統計學意義（P ＜0.05）；B 組和C 組LncRNA ROR 和TGF-β1 水平比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見表2。

表2 三組受試者LncRNA ROR 和TGF-β1 水平比較（）

表2 三組受試者LncRNA ROR 和TGF-β1 水平比較（）

注與B 組比較，aP ＜0.05；與C 組比較，bP ＜0.05。LncRNA ROR：長鏈非編碼RNA ROR；TGF-β1：轉化生長因子-β1

2.2 LncRNA ROR與TGF-β1 的相關性

Spearman 相關性分析顯示，LncRNA ROR與TGFβ1 呈正相關（r=0.897，P ＜0.05）。

2.3 三組受試者腫瘤標志物水平比較

A 組CA153、CEA 水平高于B 組和C 組，差異有統計學意義（P ＜0.05）；B 組CA153 和CEA 水平高于C 組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表3。

表3 受試者腫瘤標志物水平比較（）

表3 受試者腫瘤標志物水平比較（）

注與B 組比較，aP ＜0.05；與C 組比較，bP ＜0.05。CA153：糖類抗原153；CEA：癌胚抗原

2.4 不同指標預測乳腺癌的臨床價值比較

LncRNA ROR 和TGF-β1 預測乳腺癌的AUC 比較，差異無統計學意義（Z=0.536，P=0.592），LncRNA ROR 預測乳腺癌的AUC 高于CA153 和CEA，差異有統計學意義（Z=3.158、3.152，P=0.002、0.000）；TGF-β1預測乳腺癌的AUC 高于CA153 和CEA，差異有統計學意義（Z=2.372、2.594，P=0.018、0.010）。見表4、圖1A。以表4 中截斷值作為判定陽性依據，LncRNA ROR：陽性＞1.45，陰性：≤1.45；TGF-β1 陽性：＞17.84 μg/ml，陰性：≤17.84 μg/ml。LncRNAROR 和TGF-β1 均陽性預測乳腺癌的特異性為98.65%，高于二者單一預測的特異性值；LncRNA ROR 陽性或TGF-β1 陽性預測乳腺癌的靈敏度為100%，高于二者單一預測的靈敏度值。見表4、圖1B。

圖1 不同指標預測乳腺癌的ROC 曲線

表4 不同指標預測乳腺癌的臨床價值比較

2.5 乳腺癌患者不同臨床特征LncRNA ROR 和TGFβ1 表達水平比較

不同年齡、分化程度、表型乳腺癌患者血清LncRNA ROR 和TGF-β1 水平比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）；不同臨床腫瘤分期乳腺癌患者LncRNA ROR 和TGF-β1 水平比較，差異有統計學意義（P ＜0.05）；淋巴結轉移乳腺癌患者血清LncRNA ROR 和TGF-β1水平均高于無淋巴結轉移患者，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表5。

表5 乳腺癌患者不同臨床特征LncRNA ROR和TGF-β1 表達水平比較（）

表5 乳腺癌患者不同臨床特征LncRNA ROR和TGF-β1 表達水平比較（）

注 LncRNA ROR：長鏈非編碼RNA ROR；TGF-β1：轉化生長因子-β1；HER-2：人表皮生長因子受體-2

3 討論

多項研究[12-14]顯示，LncRNA 通過與轉錄因子、染色質修飾因子或核不均一核糖核蛋白結合調節基因表達，部分LncRNA 介導的功能破壞失調在腫瘤發生發展中發揮關鍵作用，LncRNA 在腫瘤患者診斷和預后評估方面具有潛在應用價值。LncRNA ROR 長2591 nts，又稱為LincRNA-ST8SIA3，位于18q21.31，是p53 對DNA 損傷反應的強負性調節因子，其過度表達可導致miRNA與相應基因之間的負調控，與上皮細胞-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、腫瘤生長、轉移、侵襲和化療耐藥相關[15]。

近年來的研究[16-21]顯示，LncRNA ROR與胃癌、膽囊癌、非小細胞肺癌、肝細胞癌、胰腺導管腺癌等多種癌癥發生相關，上述腫瘤組織和LncRNA ROR 表達高于正常組織，LncRNA ROR 表達升高的程度與腫瘤細胞侵襲、遷移和增殖呈正相關，但其影響腫瘤細胞生長、增殖、侵襲等生物學行為的機制尚未完全闡明。對乳腺癌來說，細胞侵襲和轉移是導致預后較差、病死率高的重要原因，而EMT 是這個過程的重要環節[22]。LncRNA ROR 是EMT 的重要陽性調節因子，體外研究顯示，LncRNA ROR 上調促進乳腺癌細胞的遷移和侵襲，體內研究則可促進免疫缺陷小鼠的腫瘤轉移[23]。TGF-β1 是誘導EMT 的重要誘導因子，可通過特異性識別下游細胞信使因子Smad2/3，使其磷酸化并與Smad4 形成寡聚體，并在細胞核內與基因啟動子結合，促使靶基因轉錄[24]。研究顯示，TGF-β1 可通過誘導EMT 促進包括乳腺癌在內的多種腫瘤轉移，在多種腫瘤組織中呈高表達[25]。Hou 等[26]研究顯示，LncRNA ROR 過度表達可通過影響TGF-β1 信號通路活性促進乳腺癌細胞增殖、侵襲及裸鼠腫瘤生長。本研究結果顯示，在乳腺癌患血清中表現為LncRNA ROR 和TGF-β1 異常高表達，與Hou 等[26]研究中LncRNA ROR 和TGF-β1 的研究結果一致。本研究結果顯示LncRNA ROR 和TGF-β1 預測乳腺癌的AUC 高于CA153 和CEA，提示LncRNA ROR 和TGF-β1 可能是乳腺癌潛在的生物標志物，鑒于本研究病例數有限，LncRNA ROR 和TGF-β1 和傳統腫瘤標志物CA153和CEA 預測乳腺癌的臨床價值差異尚需要進一步納入更多病例進行論證。二者聯合檢測的結果顯示，LncRNA ROR 和TGF-β1 均陽性作為預測因子，可提高特異性，有助于減少假陽性率，LncRNA ROR 和TGF-β1 之一陽性作為預測因子，可提高靈敏度，有助于減少假陰性率，結果提示，LncRNA ROR 和TGF-β1可能是乳腺癌潛在的生物標志物，二者不同聯合方式有助于乳腺癌的確診和排除。

臨床研究[27]顯示，TGF-β1與乳腺癌患者腫瘤分期相關，臨床分期Ⅲ期和淋巴結轉移的乳腺癌組織中TGF-β1 水平顯著升高。本研究結果同樣顯示，不同臨床腫瘤分期增加和是否淋巴結轉移的乳腺癌患者之間LncRNA ROR 和TGF-β1 比較，差異有統計學意義（P ＜0.05），這與既往研究[27]中TGF-β1 促進乳腺癌發展及淋巴結轉移的研究一致。本研究結果顯示，患者血清LncRNA ROR 和TGF-β1 表達與患者年齡、腫瘤分化程度等無關，與既往研究一致。HER2 是一種185 kD 的糖蛋白，20%～30%初診浸潤性乳腺癌顯示HER2 陽性[28-29]。Merry 等[30]曾用HER2陽性乳腺癌細胞體外培養研究LncRNA與HER2 陽性乳腺癌之間的關系，該研究發現僅三種LncRNA（linc-STARD6-2、linc-GJA1-2 和linc-SLC39A10-10）表達與HER2 表達相關，不包括LncRNA ROR。Luo 等[31]曾對乳腺癌不同表現LncRNA 功能多態性進行研究，結果顯示，LncRNA 功能多態性與雌激素受體、HER-2表達不存在相關性。本研究未觀察到LncRNA ROR 和TGF-β1與乳腺癌表現型的相關性，與既往研究一致。

綜上所述，本研究結果顯示，血清LncRNA ROR和TGF-β1 可能是乳腺癌潛在的生物標志物，患者血清LncRNA ROR 和TGF-β1 表達與臨床腫瘤分期和淋巴結轉移相關，對預后判定具有一定參考價值。