喉癌組織中miR-340-5p、c-Myc、TCF-4 的表達及臨床意義

周海婷 趙 瑜 邱 影

盤錦遼油寶石花醫院耳鼻喉科，遼寧盤錦 124010

喉癌是常見的頭頸部腫瘤，我國每年喉癌新發患者例數約有2.6 萬例，死亡約1.5 萬例[1]。目前喉癌的主要治療是手術及放化療等。但部分患者起病隱匿，部分患者發現時已為中晚期，往往需行全喉切除，患者生存時間較短[2]。揭示喉癌發生發展的機制對臨床治療意義較大。微RNA（microRNA，miRNA）是長度為19～25 個核苷酸的非編碼RNA，轉錄后調控靶基因信使RNA 的穩定性，影響基因的表達。miRNA 是參與惡性腫瘤進展的重要調節分子，對腫瘤的增殖、凋亡、浸潤及轉移等生物學過程都有影響[3]。miR-340-5p 的編碼基因位于5q35.3，研究發現在膠質瘤[4]、肺癌[5]等多種腫瘤中均存在異常表達的現象，其異常表達促進腫瘤的惡性進展。腫瘤的發生與癌基因的過度激活有關，c-Myc 是一種原癌基因，編碼一種核內磷酸化蛋白，在細胞周期、凋亡和細胞轉化中起調控作用。其編碼蛋白形成異源二聚體，與特定靶基因E 盒DNA 共有序列結合影響基因的轉錄。大量研究發現，在許多人類惡性腫瘤中均發現該基因的異常擴增的現象[6]。轉錄因子-4（transcription factor-4，TCF-4）基因位于18q21.2，該基因編碼蛋白是一種螺旋-環-螺旋TCF，能識別靶基因E 盒結合位點，在神經系統發育中起重要作用。研究表明，miR-340-5p 可以靶向調節c-Myc、TCF-4 表達參與癌癥進展[7]。因此，本研究通過研究喉癌患者癌組織中miR-340-5p、c-Myc及TCF-4 的表達，初步研究三者的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015 年2 月至2020 年11 月盤錦遼油寶石花醫院（以下簡稱“我院”）診治的102 例喉癌患者作為本研究的研究對象。納入標準：①經病理學檢查明確診斷為喉鱗狀細胞癌。②一般身體狀況良好，Karnofsky 評分>70 分。③一般資料完整。排除標準：①合并其他器官惡性腫瘤。②合并感染性疾病、自身免疫性疾病及精神障礙性疾病等。③合并嚴重的心肺等臟器功能障礙。④有放化療治療史。102 例喉癌患者中，男77 例，女25 例；年齡28～77 歲，平均（57.4±10.8）歲；腫瘤位置：聲門型44 例，聲門上型40 例，聲門下型18 例；腫瘤分期Ⅰ～Ⅱ期患者69 例，Ⅲ～Ⅳ期患者33 例；腫瘤分化高分化患者21 例，中、低分化患者81 例；淋巴結轉移：有50 例，無52 例。患者對本研究已知情并簽署同意書，本研究已經我院醫學倫理委員會審核批準。

1.2 檢測方法

1.2.1 實驗材料 總RNA 提取試劑盒購自北京索萊寶公司，貨號：R1200。逆轉錄試劑盒購自北京索萊寶公司，貨號：T2240。2×SYBR Green PCR Mastermix 試劑盒購自北京索萊寶公司，貨號：SR1110。引物序列由上海生工公司設計及合成。

1.2.2 應用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（real time fluorescence quantitative reserve transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）法檢測miR-340-5p、c-Myc及TCF-4的表達Trizol法提取癌和癌旁組織中總RNA，焦碳酸二乙酯水溶解后檢測RNA的濃度，逆轉錄為cDNA。qRT-PCR總反應體系20μl，10μlSYBRGreenPremix，正反向引物各1μl，cDNA2μl，DEPC水6μl。miR-340-5p正向引物序列：5’-ATATATTCCTATCAGTCTGTTT-3’，反向引物序列：5’-GTCCTCACTGATGCCCAGTT-3’，miR-340-5p以U6為內參，內參基因U6正向引物序列：5’-CGC-TTCGGCAGCACATATACTAA-3’，反向引物序列：5’-TATGGAACGCTTCACGAATTTGC-3’；c-Myc正向引物序列：5’-GGCTCCTGGCAAAAGGTCA-3’，反向引物序列：5’-CTGCGTAGTTGTGCTGATGT-3’；TCF-4正向引物序列：5’-CAAGCACTGCCGACTACAATA-3’，反向引物序列：5’-CCAGGCTGATTCATCCCACTG-3’；c-Myc及TCF-4 以GAPDH 為內參，內參基因GAPDH正向引物序列：5’-CATCTCTGCCCCCTCTGCTGA-3’，反向引物序列：5’-GGATGACCTTGCCCACAGCCT-3’。miR-340-5p 的qPCR 反應條件為：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，70℃延伸30 s，共40 個循環。c-Myc及TCF-4 的qRT-PCR 反應條件為：94℃5 min，94℃20 s，60℃25 s，70℃34 s，共39 個循環。miR-340-5p、c-Myc及TCF-4 的表達水平以相對定量法2-ΔΔCt值表示。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0 軟件對所得數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，比較采用t檢驗；計數資料采用例數或百分率表示，比較采用χ2檢驗。miR-340-5p、c-Myc及TCF-4 之間的相關性分析采用Pearson 線性相關分析。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 癌和癌旁組織中miR-340-5p、c-Myc及TCF-4的相對表達量比較

與癌旁組織比較，癌組織中miR-340-5p 的相對表達量明顯降低，而c-Myc、TCF-4 的相對表達量明顯升高（P ＜0.05）。見表1。

表1 癌和癌旁組織中miR-340-5p、c-Myc及TCF-4 的相對表達量比較（）

表1 癌和癌旁組織中miR-340-5p、c-Myc及TCF-4 的相對表達量比較（）

注 miR-340-5p：微RNA-340-5p；TCF-4：轉錄因子4

2.2 癌組織中miR-340-5p、c-Myc及TCF-4 表達與臨床病理特征的關系

不同腫瘤分期的喉癌組織中miR-340-5p、c-Myc及TCF-4 的表達，差異有統計學意義（P ＜0.05）；不同年齡、性別、分型、腫瘤分化程度及是否伴有淋巴結轉移比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見表2。

表2 癌組織中miR-340-5p、c-Myc及TCF-4 表達與臨床病理特征的關系（）

表2 癌組織中miR-340-5p、c-Myc及TCF-4 表達與臨床病理特征的關系（）

注 miR-340-5p：微RNA -340-5p；TCF-4：轉錄因子4

2.3 癌組織中miR-340-5p、c-Myc及TCF-4 的表達的相關性

Pearson 線性相關分析結果顯示，miR-340-5p 和c-Myc、TCF-4 的表達呈負相關（r=-0.549、-0.452，P=0.000、0.000），而c-Myc與TCF-4 表達無相關性（r=0.167，P=0.094）。見圖1。

圖1 癌組織中miR-340-5p、c-Myc及TCF-4 表達的相關性

3 討論

喉癌是我國常見的惡性腫瘤之一，喉鱗狀細胞癌是最常見的病理類型，腺癌等類型較為少見。喉癌發病位置特殊，隨著腫瘤進展，會影響患者發音及呼吸吞咽等喉部正常功能。因此，針對喉癌的治療會不同程度影響喉部正常生理功能[8]。深入研究喉癌的發病機制，有助于尋找早期診斷喉癌或判斷預后的腫瘤標志物。喉癌的發生受遺傳、環境等多種因素的影響，如吸煙、飲酒及職業暴漏等因素。喉癌的發生發展是一個多階段、多機制的過程，涉及癌基因的激活、抑癌基因的失活等改變[9]。因此，尋找喉癌關鍵的致病癌基因或抑癌基因及其調控機制，對臨床診斷及治療具有重要意義。

以往認為，非編碼RNA 如miRNA、長非編碼RNA 等是轉錄過程中的轉錄噪音，而近年來發現，miRNA 可特異性結合下游靶基因mRNA 的3’-非編碼區，影響mRNA 的穩定性，調控多種靶基因的表達，與腫瘤、自身免疫性疾病等多種人類疾病密切相關，有望成為早期診斷喉癌的腫瘤標志物[10-11]。本研究顯示，癌組織中miR-340-5p 表達降低，提示miR-340-5p 在喉癌中發揮抑癌基因的作用。目前喉癌中miR-340-5p 表達下調的機制不明，結合以往研究，推測與長鏈非編碼RNA 對miR-340-5p 表達調控有關。如長鏈非編碼RNA LINC00662，可作為分子海綿或分子支架直接結合miR-340-5p，同時抑制miR-340-5p 的表達，促進腫瘤的增殖及侵襲，而在體外細胞實驗中發現腫瘤細胞中敲除LINC00662 后，miR-340-5p 表達水平升高，腫瘤的增殖及侵襲能力降低[12]。本研究結果顯示，癌組織中miR-340-5p 的表達與腫瘤TNM 分期有關，提示miR-340-5p 表達降低參與促進喉癌的進展。有研究報道，miR-340-5p通過靶向抑制多聚梳抑制復合體2 的表達，進而抑制磷脂酰肌醇3 激酶/AKT 信號通路的過度激活，抑制腫瘤細胞的過度增殖，而miR-340-5p 表達降低導致腫瘤細胞的過度增殖及凋亡減少，引起腫瘤分期升高[13]。

腫瘤的發生發展與癌基因的過度激活有關。c-Myc及TCF-4 是常見的原癌基因，在多種人類腫瘤中均表現為過度表達的現象，促進腫瘤的增殖、凋亡、浸潤及轉移等生物學行為[6-7]。本研究中，喉癌癌組織中c-Myc、TCF-4 的相對表達量均明顯高于癌旁組織。分析其原因，一方面，c-Myc 表達增加與c-Myc癌基因擴增有關，研究表明，多種腫瘤中均存在c-Myc基因擴增的現象，導致c-Myc 表達水平升高[14]。另一方面，TCF-4 表達同時受到轉錄后調控。有學者發現，miR-139 可結合并抑制TCF-4 的表達，而癌細胞miR-139 異常表達下調促進腫瘤細胞的增殖及浸潤[15]，此外，c-Myc、TCF-4 的表達與較高的腫瘤TNM 分期有關。首先，c-Myc 作為一種螺旋-環-螺旋結構的TCF，是促進細胞增殖關鍵因子，其表達水平升高能夠促進細胞周期進程，導致腫瘤細胞無限增殖，促進腫瘤的惡性進展[16-17]。此外，研究表明，TCF-4 能夠與β-連環蛋白結合形成二聚體，促進單核細胞趨化蛋白1 的表達，其表達水平增加導致腫瘤微環境處于免疫耐受的狀態，促進腫瘤的增殖、侵襲及血管生成，導致腫瘤分期升高[18-19]。

本研究中，癌組織中miR-340-5p與c-Myc、TCF-4 表達呈負相關，其機制可能與miR-340-5p 對c-Myc、TCF-4 基因表達調控有關。有學者在體外細胞實驗中亦證實miR-340-5p與c-Myc、TCF-4 表達呈負相關，喉癌Hep2 細胞系中miR-340-5p 表達較低，c-Myc、TCF-4 的表達較高，而在過表達miR-340-5p后，c-Myc 和TCF-4 的表達水平均顯著降低[20-22]。目前喉癌中miR-340-5p 對c-Myc、TCF-4 表達的調控機制尚不清楚。Rongxin等[23]、Zhang等[24]對骨肉瘤的研究表明，信號轉導及轉錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription3，STAT3）是miR-340-5p 的直接作用靶點，腫瘤中miR-340-5p 的低表達導致STAT3 表達上調，激活Wnt/β 連環蛋白通路，促進c-Myc、TCF-4 的表達。此外，大量文獻亦證實，STAT3 能夠直接促進細胞中c-Myc、TCF-4 基因的表達，促進腫瘤的惡性進展[25-27]。因此，c-Myc、TCF-4 表達的表達可能受到miR-340-5p 的間接調控，進而影響腫瘤細胞增殖及侵襲能力。

綜上所述，喉癌組織中miR-340-5p 表達降低，而c-Myc及TCF-4 表達升高，miR-340-5p 表達與c-Myc及TCF-4 呈負相關，三者共同促進喉癌的腫瘤進展，有望成為新的診斷及治療喉癌靶點的潛能，值得深入探索。