多糖作為免疫佐劑的研究進展①

姜紅蕾 王鳳山（山東大學藥學院生化與生物技術藥物研究所，濟南 250012）

接種疫苗是產(chǎn)生充分的保護性免疫反應來預防和控制傳染病傳播的最有效策略。疫苗需要有強的免疫原性才能刺激機體產(chǎn)生免疫應答，但單純由抗原組成的疫苗往往因其免疫原性弱而無法起到預防感染性疾病的作用，因此需要佐劑（adjuvant）來增強免疫反應。目前，鋁佐劑是FDA 唯一批準用于人體的佐劑，雖然已經(jīng)使用了80 余年，卻只能誘導Th2 型免疫反應［1］。歐洲批準使用的MF59（水包油型乳劑）可同時引起Th1 和Th2 型免疫應答，但其會在注射部位引起不良反應［2］。因此，開發(fā)新型的佐劑以克服現(xiàn)有佐劑的不足具有重要意義。許多多糖具有促進機體特異性免疫和非特異性免疫的作用，且具有低毒、安全等特點，可能成為理想的疫苗佐劑。本文綜述了殼聚糖、菊糖、葡聚糖、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、中藥多糖等作為免疫佐劑的研究，并對其作為佐劑的前景進行了展望。

1 殼聚糖

殼聚糖（chitosan）是由幾丁質N-脫乙酰化形成的天然多聚糖。在酸性介質中，殼聚糖分子上的氨基以-NH3+的形式存在，是唯一一種陽離子多糖，這一特性使殼聚糖能夠被制成微顆粒、納米顆粒等劑型［3］。殼聚糖作為免疫佐劑的特性由NISHIMURA 等［4］在1984年首次報道。在之后的30多年間，對殼聚糖進行了大量研究。殼聚糖可通過TLR4 促進樹突狀細胞（dendritic cells，DC），能上調(diào)CD80 和CD86 表達，但未能激活T 細胞產(chǎn)生相應的細胞因子［5］，這表明單純殼聚糖不能引起T細胞相關免疫反應。而殼聚糖及其衍生物與抗原結合后，可彌補殼聚糖本身的免疫缺陷。研究表明殼聚糖包裹卵清蛋白（OVA）的納米顆粒后可刺激主要組織相容性復合體（MHC）Ⅰ類分子的表達，顯著上調(diào)共刺激因子CD40、CD80、CD86 的表達，促進細胞因子IL-6、IL-12、MIP-1、TNF-α 的分泌，并刺激CD4+和CD8+T 細胞的增殖［6-7］。殼聚糖顆粒已被證實可激活NLRP3 炎癥小體，該途徑可促進中性粒細胞的募集和抗原提呈細胞（APC）的成熟，并可產(chǎn)生以IL-1β和IL-18 等細胞因子分泌為特征的炎癥環(huán)境［8］。也有研究表明，殼聚糖可通過參與cGAS-STING 途徑激活DC 并促進Th1 反應［9］。這表明殼聚糖能夠通過多個途徑刺激產(chǎn)生免疫應答。

近年來，殼聚糖在黏膜疫苗佐劑中也展現(xiàn)出了獨特應用前景。殼聚糖由于其獨特的陽離子特性，具良好的黏膜黏附性，能延長抗原的滯留時間，并且能打開黏膜上皮細胞間的緊密連接，使抗原被黏膜APC 識別引起一系列免疫應答［10］。將EV71 腸病毒的衣殼蛋白VP1 與殼聚糖混合，通過灌胃免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生大量IgG 抗體，誘導脾細胞產(chǎn)生高水平的Th1、Th2 和Th3 免疫反應，且在小腸道、陰道、糞便、呼吸道中檢測出大量的VP1 特異性IgA 抗體，說明VP1 與殼聚糖混合給藥后可引起小鼠黏膜免疫應答［11］。將O-季銨化殼聚糖和硫酸化可德蘭多糖制備形成納米顆粒荷載OVA 抗原，對小鼠滴鼻給藥后，在其口腔和陰道黏膜部位中也均發(fā)現(xiàn)了OVA特異性IgA 的表達［12］。由殼聚糖（ChiSysTM）、單磷酰脂質（MPL）和諾如病毒VLP抗原制成的粉末噴霧疫苗（NV-VLP）已進行了Ⅰ期臨床試驗，其結果表明，在人體中NV-VLP 具有良好的耐受性，無嚴重不良反應，并引起腸黏膜組織（諾如病毒的進入部位）分泌IgA［13］。

2 菊糖

菊糖（inulin），又名菊粉，是一種的天然果糖聚合物，是植物體內(nèi)的一種貯存多糖。菊糖主要存在α、β、γ、δ 4 種構型。其中α、β 構型在常溫下溶解，而γ 構型菊糖要達到37℃溶解。δ 菊糖需要在40℃下才能溶解，但當其開始冷卻后需要反復加熱處理才可以重新轉化為δ-菊糖。在1946 年科學家就發(fā)現(xiàn)了可溶的菊糖，這些溶解性的菊糖不能激活補體或增強適應性免疫應答，表明菊糖的免疫作用與其顆粒的特定包裝結構密切相關［14］。菊糖的γ 和δ 構型都具有免疫佐劑性質。其中，γ-菊糖能夠使巨噬細胞表面的C3 片段沉積，從而導致T 細胞活化，但γ-菊糖在消毒時結構和性質不穩(wěn)定［15］。而δ 構型具有很好的溫度穩(wěn)定性，其在伽馬射線滅菌后結構無變化，還具有很好的免疫活性。目前δ-菊糖主要被制備成AdvaxTM作為免疫佐劑使用，AdvaxTM是由直徑1～2μm的層狀晶體圓形δ-菊糖微粒，這種特殊的微粒結構是AdvaxTM激活免疫系統(tǒng)的關鍵［16］。在研究中，證實了AdvaxTM對乙型肝炎病毒（HBV）、日本腦炎病毒、SARS 冠狀病毒、艾滋病毒（HIV）、呼吸道合胞病毒（RSV）、李斯特菌、炭疽桿菌等多種病原微生物有免疫佐劑作用。早期研究中，用AdvaxTM和乙型肝炎表面抗原（HBsAg）聯(lián)合免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)，HBsAg 特異性抗體滴度升高，能促進CD4+和CD8+T細胞增殖和Th1、Th2 和Th17 細胞因子產(chǎn)生［17］。與明礬組相比用，AdvaxTM至少可節(jié)省4 倍的抗原劑量。AdvaxTM用于流感疫苗中也能使免疫細胞增殖，使特異性抗體提高，且效果持久，在免疫后1年免疫作用仍然十分明顯。由AdvaxTM為佐劑制成的乙肝疫苗和流感疫苗已經(jīng)完成臨床Ⅰ期試驗，其結果表明AdvaxTM具有良好的耐受性，未發(fā)現(xiàn)安全性問題［18-19］。除了可以用于傳統(tǒng)的免疫方式，AdvaxTM也可通過黏膜給藥。TOMAR 等［20］將AdvaxTM與滅活流感病毒混合制成噴霧劑，通過鼻內(nèi)免疫后與未加佐劑組相比，能夠引起更高的全身、黏膜和細胞免疫應答。肺內(nèi)免疫時，AdvaxTM可增加肺內(nèi)因子CXCR3、CD69 和CD103 的表達。因此，AdvaxTM是一種很好的潛在黏膜佐劑。

目前，盡管對AdvaxTM有大量研究，但AdvaxTM的免疫機制尚不明確。推測其主要作用機制是先激活APC，與抗原結合，誘導與增強抗原呈遞和抗原特異性相關的表型變化，包括使CD4+和CD8+T 細胞增殖，以及抗原刺激的IFNγ、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17 和GM-CSF 的表達上調(diào)。并且，不同于傳統(tǒng)的佐劑明礬，AdvaxTM沒有強烈的Th2 或Th1 偏倚。同時，AdvaxTM佐劑不能誘導巨噬細胞產(chǎn)生促炎細胞因子TNF-α和IL-1，不會誘導炎癥小體活化［17］。其佐劑作用不依賴于抗原吸收，因為即使在抗原免疫前1 d注射AdvaxTM，抗體反應也會增強。

3 葡聚糖

葡聚糖可分為α-葡聚糖和β-葡聚糖。大多數(shù)葡聚糖來源于植物或微生物，種類繁多。具有佐劑活性的α-葡聚糖主要有右旋糖酐，β-葡聚糖主要有海帶多糖、香菇多糖、酵母聚糖等。

3.1 α-葡聚糖 右旋糖酐（dextran）是由多個葡萄糖縮合而成的同聚多糖。右旋糖酐硫酸化后具有廣泛的促炎作用，是一種有效的引起細胞介導的遲發(fā)型超敏反應的免疫佐劑［21］。二乙基氨基乙基（DEAE）-葡聚糖是右旋糖酐的衍生物，已被用作獸用佐劑。在另一項研究中發(fā)現(xiàn)，乙酰化葡聚糖（Ac-DEX）微粒可調(diào)節(jié)疫苗的釋放和抗原的遞送。CHEN 等［22］將Ac-DEX 微粒和OVA 共同免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)，Ac-DEX 微粒作為佐劑可以誘導更強的IgG、IgG1 和IgG2a 水平，這可能是由于增強了細胞攝取和促進了細胞內(nèi)的通路。此外，與鋁佐劑組相比，Ac-DEX 微粒產(chǎn)生了更平衡的Th1/Th2 應答。研究還表明，Ac-DEX 微粒可通過調(diào)節(jié)抗原的釋放從而改變到達最強免疫的時間。這為生產(chǎn)更加安全有效的疫苗佐劑提供了研究基礎。

3.2 β-葡聚糖 β-葡聚糖主要來源于生物的細胞壁，如酵母、某些種類的海藻等。在研究中，β-葡聚糖沒有明顯的毒性或副作用。由于不同種類β-葡聚糖結構的差異，其免疫作用也存在差異。總的來說，β-葡聚糖可作為病原相關分子模式（PAMP）被免疫細胞表面的Toll 樣受體、dectin-1、CR3 和CD5受體識別。β-葡聚糖和受體間的相互作用觸發(fā)細胞內(nèi)信號激活免疫相關分子的表達和調(diào)節(jié)免疫應答。從釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）細胞壁上獲得的β-葡聚糖能激活巨噬細胞、單核細胞、DC，導致炎癥，刺激分泌TNF-α、IL-8、活性氧自由基（ROS）和花生四烯酸等炎癥因子［23］。有研究發(fā)現(xiàn)，dectin-1受體的激活同時活化了Toll樣受體介導的NF-κB，dectin-1受體和Toll樣受體協(xié)同介導細胞因子的產(chǎn)生［24］。還有研究表明，蘑菇多糖可降低OVA 誘導的Th2 免疫應答，增強Th1型免疫應答，從而表明其不僅能夠激活固有免疫應答，也能激活適應性免疫應答［25］。將葡聚糖制備成微粒后作為抗原載體也能引起強免疫反應。DEEPE 等［26］用葡聚糖微粒包裹莢膜組織胞漿菌的堿性提取物鼻腔免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)肺和脾臟的菌落數(shù)明顯下降，且肺內(nèi)的IFN-γ、IL-17 分泌增加，引起Th1 和Th17 T 細胞免疫應答。為了引起更加強烈和平衡的免疫應答，LIU 等［27］通過添加其他類型佐劑制成微粒來增強葡聚糖的佐劑性，調(diào)節(jié)免疫反應方向。近年來，進行了葡聚糖通過黏膜給藥途徑進行免疫的研究。例如，小鼠口服β-葡聚糖后，腸上皮內(nèi)淋巴細胞數(shù)量增加，細胞因子IFN-γ 分泌增加，迅速引起黏膜部位產(chǎn)生T細胞免疫應答［28］。在接觸病原的早期，使黏膜部位快速產(chǎn)生免疫應答，防止組織感染的發(fā)生。

4 LPS

LPS 是革蘭氏陰性菌外膜的一部分，一般占外膜的35%～45%。毫無疑問，LPS 是天然免疫的誘導劑和增強劑。傳統(tǒng)上，一般認為LPS 能夠被細胞上TLR4 識 別，激 活MyD88（myeloid differentiation primary response gene 88）和TIR（Toll/IL-1 receptor）通路，誘導巨噬細胞活化和炎癥細胞因子產(chǎn)生，使T細胞的反應向Th1 轉移［29-30］。最近，有研究發(fā)現(xiàn)LPS可觸發(fā)caspase-11 介導的非典型炎癥小體［30-31］。而LPS無法作為人類佐劑使用主要是由于其能強烈激活MyD88 通路，導致不必要的、潛在有害的炎癥反應。從20世紀70年代開始，對LPS進行了大量的改造實驗，并成功制備了毒性更低，免疫作用強的單磷酰脂質A（monophosphoryl lipid A，MPLA）。根據(jù)臨床研究，MPLA 是一種安全的佐劑［32-33］。MPLA 是70 多年來第1 個被批準作為佐劑使用的TLR 激動劑，也是第1個用于人類的新佐劑。MPLA在保留免疫刺激活性的同時降低毒性的主要原因之一是MyD88 減少信號而TRIF（toll-interleukin 1 receptor domain-containing adapter inducing interferon-beta）途徑保留信號［34］。與MyD88 相比，TRIF 途徑在允許TLR4 激動劑介導的早期T 細胞反應的刺激方面發(fā)揮更顯著的作用。目前，由葛蘭素史瑞克公司研制的AS01、AS02、AS04佐劑中都含有MPLA，已被批準用于瘧疾疫苗、乙肝病毒疫苗、人乳頭瘤病毒疫苗等多種疫苗中。表1為幾種研究較多的多糖免疫作用及其作為佐劑的研究現(xiàn)狀。

表1 多糖的免疫作用及其研究現(xiàn)狀Tab.1 Immunity and research status of polysaccharides

5 中藥多糖

除了以上所述的幾類多糖以外，中藥多糖也具有發(fā)展為佐劑的潛能。由于中藥來源和種類廣泛，中藥多糖的種類也很繁多，每種中藥多糖具有獨特的免疫作用。總的來說，中藥多糖可增強細胞因子的表達、CD4+和CD8+T 細胞的活化以及NK 細胞的活性，從而產(chǎn)生強大的免疫調(diào)節(jié)作用并促進人體的體液免疫功能。科學家們對黃芪多糖、當歸多糖、枸杞多糖、茯苓多糖、牛膝多糖、板藍根多糖等的佐劑作用進行了大量研究，免疫效果也各有不同。黃芪多糖增強網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬細胞的吞噬作用，促進淋巴細胞轉化，激活T 細胞和B 細胞，并能促進抗體形成，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，并且可以增強遞呈口蹄疫病毒、禽流感病毒、乙肝病毒等多種抗原的免疫原性［36-37］。當歸多糖作為新城疫病毒疫苗佐劑可提高血凝反應，在免疫后期提高抗體滴度［38］。枸杞多糖能顯著增強機體神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡的調(diào)節(jié)功能［39］。枸杞多糖脂質體可誘導DCs 的成熟，誘導其活化，促進抗原特異性體液免疫應答，導致Th1 和Th2 細胞因子水平升高。枸杞多糖脂質體還可促進TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB 基因表達［40］。茯苓多糖作為流感疫苗佐劑免疫效果強烈。在攻毒實驗中，茯苓多糖能提高小鼠流感病毒的致死劑量，提高了滅活流感疫苗的免疫效果［41］。多種中藥多糖可以合理配伍制備成復合成多糖佐劑配方（CPS），從而引起更加廣泛且強大的免疫應答。何云富等［42］以對豬O 型口蹄疫病毒（FMDV）滅活抗原具有佐劑效應的黃芪多糖、人參多糖、木蟞子多糖、茯苓多糖和云芝多糖5 種多糖為佐劑成分制備成CPS，免疫后雖然CPS 不能刺激抗體分泌，但能顯著提高血清中IL-2、TNF-α、IFN-γ 的分泌，進一步擴大Th1應答效應，使機體發(fā)揮更有力的細胞免疫。

6 總結

作為佐劑，多糖無毒且副作用少。由于分子量相對較大、能與免疫細胞表面受體識別結合等特點，易作為抗原被多種免疫細胞識別，從而激發(fā)多種免疫機制。許多多糖還能夠引起黏膜免疫應答，這為通過黏膜部位感染機體病原體疫苗的研究提供了新的策略和思路。多糖與其他免疫佐劑制成復合佐劑產(chǎn)生協(xié)同效應從而引發(fā)更加強烈全面免疫效果，也已逐步成為熱點研究方向。由于多糖本身的多樣化，每種多糖引起的免疫應答的機制并不清晰，需要進一步探索。且其生產(chǎn)質量控制也面臨巨大挑戰(zhàn)，需要制定更加詳細嚴格的質量標準。這些將成為促進多糖疫苗佐劑的臨床開發(fā)和商品化進程的關鍵。