自制核心耗材促進大型儀器設備在實驗教學中的應用

萬 建， 汪 兵， 周 權， 阮 君， 張 迪， 李 兵

（華中師范大學a.生命科學學院；b.湖北省生物學實驗教學示范中心；c.國家級生物學虛擬仿真實驗教學示范中心，武漢 430079）

0 引 言

大型儀器技術的革新與進步推動著生命科學的高速發展，特別是生命科學進入后基因組學時代，以蛋白組學、代謝組學為代表的組學時代蓬勃發展依賴著高精密儀器設備的革新［1-3］。將前沿生物學研究技術運用到本科生及研究生的培養過程［4］，開闊學生視野，提升專業技能，強化專業學生核心素養的培養，是滿足“雙一流”人才培養的重要保障［5］。

大型儀器設備高分辨液相色譜質譜聯用系統運用到實驗教學中，需要解決大型儀器實驗耗材昂貴、實驗教學與理論教學不匹配、大型儀器設備機時飽滿等問題［6］。通過技術攻關自制核心耗材、實驗項目構建貼近理論課程需求建立了基于高分辨液相色譜質譜聯用技術的蛋白質磷酸化修飾鑒定［7］教學實驗流程。同時創新實驗教學課堂模式，將大型儀器實驗操作融入生物技術創新大實驗，以小組的形式開展探究性實驗；結合大學生創新創業大賽、大學生實驗技能大賽等賽事豐富實驗教學模式，讓學生真正做到活學活用，提升學生生物專業核心素養。

1 核心耗材自制降低實驗教學成本

實驗教學項目使用液相色譜為賽默飛的EASYnLC 1200儀器，需要使用毛細管色譜柱完成肽段分離。在實際實驗教學過程中，由于學生初次操作，極易因樣品制備不純或樣品除鹽不徹底而引起色譜柱的堵塞，而目前商業化毛細管色譜柱報價較高，無法在實驗教學中廣泛運用，故毛細管色譜柱為實驗核心耗材。實驗教學中心創新使用激光拉針儀和混懸法填柱機自制毛細管色譜柱制備方法（已申請國家發明專利，申請號：201911124668.6），優化毛細管色譜柱制作流程，極大降低實驗耗材成本。自制毛細管色譜柱見圖1。色譜柱填料C18，3μm，150A，柱尖內徑10μm，毛細管內徑100μm，毛細管外徑360μm，柱長15 cm。

圖1 自制毛細管色譜柱實拍圖，放大倍數10×

2 貼近理論教學需要構建試驗項目

設計蛋白質組學磷酸化修飾位點鑒定實驗項目，同時在實驗教學設計過程中，融入生物全蛋白提取與鑒定、全蛋白組學定性定量分析等實驗內容。由于實驗教學項目對實驗教學課時有要求，因此本項目優化實驗材料與實驗流程以及質譜參數設定，單次實驗課時可控制在4個學時。同時實驗項目的設定緊貼理論課要求，滿足人才培養的需要。具體實驗流程如下：

2.1 實驗材料及設備

12 h復水發菜；C18填料（Agela公司）；乙腈（Fisher公司）；純水（Fisher公司）；甲酸（Fluka公司）；聚合物微球（自制）；胰蛋白酶（上海生工）；上樣緩沖液（Qiagen）；硫酸肽（國藥）；洗脫緩沖液（Qiagen）；氯化鈉（國藥）；雙氧水（國藥）。

液相質譜聯用儀Q-Exactive Plus（ThermoFisher公司）；激光拉針儀（sutter公司）；填柱機（自制），離心機D1008（SCILOGEX公司）；離心濃縮儀（labconco公司）；Proteome Discoverer 2.4 SP1（ThermoFisher公司）；開源蛋白數據庫檢索網站（http：／／www.uniprot.org／）。

2.2 實驗方法

發菜胞內蛋白提取與酶解參照文獻［8］的方法進行處理。設置發菜胞內全蛋白磷酸化富集樣品組以及發菜胞內全蛋白未磷酸化富集對照組。富集材料使用自制的聚合物微球材料。

（1）富集材料活化。①稱量聚合物微球300 mg，硫酸肽固體30 g，加入250 mL燒瓶中，加入150 mL超純水，超聲分散5 min，再用磁力攪拌，室溫過夜反應。（此步驟耗時較長，可設置前1天實驗課的學生操作留用，且準備部分備用。）②將勻漿好的材料轉移到50 mL離心管中，20 000 g離心3～5 min，棄掉上清。③洗滌聚合物微球材料：加入適量0.1%TFA將材料分散，轉移到15 mL離心管中震蕩洗滌未鍵合的Ti4＋，15 000 g離心5 min，棄上清，重復5～6次，盡量洗干凈Ti4＋。④鹽洗。用200 mM NaCl／0.1%TFA水溶液水洗聚合物微球材料一次。⑤水洗。鹽洗之后，再用0.1%TFA洗滌2～3次，然后轉移到1.5 mL離心管中，15 000 g離心，去掉上清保存。⑥質檢。取100 μL最后一次洗滌的上清液，加入到100μL 30%雙氧水中，若溶液不變色，呈現無色透明的狀態，說明Ti4＋已經洗凈，若溶液變色，則繼續洗滌。取少量材料，加入到100μL 30%雙氧水中，若溶液變成明顯的黃色，則說明材料螯合成功。

（2）磷酸化蛋白富集。①蛋白酶解液與上樣緩沖液按體積比1∶1混合均勻，然后按材料∶蛋白＝25∶1（m／m）加入聚合物微球材料，室溫1 500 g震蕩材料30 min，15 000 g離心5 min，棄掉上清液。②加入100μL水溶液重懸，1 500 g震蕩30 min，15 000 g離心5 min，棄上清。③離心后的材料中，加入100μL水溶液重懸，1 500 g震蕩30 min，15 000 g離心5 min，棄上清。④沉淀中加入150μL洗脫緩沖液，震蕩15 min，冰浴超聲15 min，20 000 g離心5 min，收集上清；加入少量洗脫緩沖液，震蕩5 min。20 000 g離心5 min，收集上清，合并2次上清，20 000 g離心5 min，將上清移至新管。⑤離心濃縮樣品，加水溶解后上質譜檢測。

2.3 色譜分離

流動相。A相為0.1%的甲酸水溶液，加5%乙腈；B相為90%的乙腈水溶液，加0.1%甲酸［9］。流速為500 nL／min，洗脫梯度見表1。進樣量為1μL。

表1 色譜洗脫梯度

2.4 質譜檢測

質譜采用質譜儀Q-Exactive Plus儀器，離子源為HESI。主要質譜采集數據參數：采集模式為正離子模式：離子源電壓設為2.2 kV；質譜采集設置：一級采集分子量范圍：350～2 000 m/z；最大離子注入時間20 ms；分辨率70 000；二級質譜最大離子注入時間50 ms；采集分辨率17 500；TopN設定為20；碎裂能量27 eV［10］。

2.5 生物信息學分析

將實驗組和對照組數據導入到配套數據處理軟件Proteome Discoverer 2.1 SP1中，在開源蛋白數據庫網站Uniport（http：／／www.uniprot.org／）下載發菜蛋白庫，導入數據處理軟件［11］。

2組數據使用同一檢索條件，檢索條件設置如下：比對數據庫勾選導入的發菜全蛋白數據庫；比對多肽質量范圍350～5 000Da；信噪比（S/N）＞1.5；母離子誤差＜10×10－6；多肽片段誤差＜0.2Da；多肽片段中氨基酸個數范圍6-144；肽段可變修飾選擇磷酸化修飾，修飾位點選擇S（絲氨酸）T（蘇氨酸）Y（酪氨酸）3個位點。正反數據庫比對檢驗閾值，顯著0.05，極顯著0.01。

2.6 結果分析

2.6.1 質譜譜圖分析

本次實驗組與數據庫匹配譜圖31 593個，得到肽段2 472條，最終定位得到840個發菜蛋白。對照組匹配35 986個數據庫譜圖，得到3 108條肽段，定位得到1 028個發菜蛋白。實驗組鑒定到蛋白數目小于對照組，分析判斷磷酸化富集過程可能會帶來一定數量的蛋白丟失。

2.6.2 磷酸化蛋白鑒定與分析

實驗組共鑒定到磷酸化蛋白質95個，磷酸化肽段112個及磷酸化位點217個，對照組未鑒定到磷酸化修飾。數據中分析得到肽段：KPEDTAIHNK在實驗組和對照組均被鑒定，檢索結果顯示肽段在T（蘇氨酸）位點有磷酸化修飾，見圖2。

圖2 磷酸化蛋白質Nfla＿6602富集后與富集前的譜圖

2.6.3 實驗項目處理

由于本實驗項目用到液相色譜質譜聯用儀為大型儀器設備，臺套數有限，故實驗小組設置4人一組，每個實驗組獨立完成一次本次實驗。實驗設置實驗組和對照組，實驗項目完成后，實驗小組可對本實驗小組數據進行分析，同時要求和其他實驗小組數據進行比對分析，比較蛋白樣品富集效率完成實驗數據分析。實驗小組可根據小組數據對磷酸化位點進行分析，可擴展分析該蛋白的生物學功能，并完成實驗報告。

3 創新實驗課題豐富實驗教學模式

大型儀器設備需要承擔大量的科研任務，而實驗教學作為一項教學任務需要在規定的課時內完成實驗教學項目。因此本實驗教學項目創新教學模式，將實驗項目融入學院特色的生物技術大實驗中，學生根據自己的興趣選擇實驗項目，并以3～5人的小組形式開展實驗，靈活安排實驗進度，方便協調高分辨質譜儀科研與實驗教學機時。同時實驗中心積極鼓勵學生參加大學生創新創業大賽、大學生實驗技能大賽等比賽，鼓勵學生在參賽項目中運用本實驗教學項目，以賽促學，促進學生對實驗教學項目更深層次的理解。

4 結 語

生命科學的發展離不開實驗技術與方法的革新［12］。將前沿生物實驗技術應用到本科實驗教學中有利于提高學生對生命科學的認知［13］，同時開闊學生視野［14］。但是大型儀器設備由于臺套數少、實驗樣品前處理復雜、實驗耗材昂貴、儀器機時飽滿、實驗教學項目與理論課程不匹配等因素限制了其在實驗教學中的應用［15］。通過自制毛細管色譜柱降低實驗項目耗材價格，優化實驗步驟選取合適實驗材料，探索一套適合本科實驗教學的蛋白組學磷酸化富集實驗項目。

該項目以創新實驗課程在研究生實驗教學中開展，受到師生的一致好評。實驗教學項目自開設以來，參與本科生畢業論文8篇，支撐大學生創新創業大賽等賽事獎項13項，指導教師獎項2項。中心將進一步優化實驗流程以及耗材準備，將更多的大型儀器推廣到實驗教學，為一流人才的培養貢獻力量。