MALDI質譜成像的實驗教學設計

王珊珊， 王英輝

（長安大學理學院，西安 710064）

0 引 言

質譜（Mass spectrometry，MS）作為一種獨特的分析技術，自身具有跨學科的特性。近年來，隨著科學技術的進步，質譜儀器和技術均實現了迅猛發展，特別是隨著電噴霧離子化及基質輔助激光解吸離子化（Matrix assisted laser desorption ionization，MALDI）這兩種軟電離離子化技術的引入，質譜已成為環境學［1］、生物學［2］、醫學［3］等領域不可或缺的分析工具。

1997年，范德堡大學的Richard Caprioli教授等［4］所提出MALDI質譜成像（mass spectrometry imaging，MSI）技術，更是打開了質譜用于復雜生物樣本原位分析的大門。MALDI MSI在經歷了20多年的發展和改進后，相關的儀器技術和樣品前處理方法已經較為成熟，可以應用于高校實驗教學中。

其中MALDI MS的實驗教學工作已經在一些高校中開展，且相關的實驗教學設計已經被報道［5-9］，但在MALDI MS基礎上衍生出的MALDI MSI技術的實驗教學設計并未見相關報道。這主要由于MALDI MSI實驗過程相比于MALDI MS實驗過程更為復雜，操作繁瑣耗時。MALDI MSI實驗通常包括樣本冷凍切片，樣本切片后的真空脫水，組織染色比對，成像基質的涂覆和成像數據采集及最后的成像數據處理這些復雜的過程［10-11］。一次完整的MALDI MSI實驗通常需耗時12 h，導致其難以在高校實驗教學中開展。本實驗教學設計通過使用磷脂標準品代替復雜的切片樣本，以免去繁瑣耗時的組織收集和處理過程，大大簡化了樣本前處理步驟，縮短了實驗時間和簡化了操作步驟，使其可以應用于高校教學中。值得注意的是，本實驗中雖然簡化了樣本前處理步驟，但是MALDI MSI中最為主要的實驗操作步驟和數據處理過程仍囊括其中。學生通過該實驗不僅可以掌握MALDI MSI的實驗原理和儀器操作方法，還可以學習到MALDI MSI相關的數據處理和結果呈現方法。這些對于學生們后續的科學研究具有很好的指導意義，有助于培養學生的實踐創新能力，使學生了解前沿的分子成像技術，拓寬其科研視野，讓高校的大型儀器更好地服務于師生的科研和教學工作。

1 實驗原理

MALDI MSI是在MALDI MS基礎上發展出的一種新型分子原位成像技術，它的主要原理（見圖1）是先將切片后樣本貼附于氧化銦錫（Indium tin oxide，ITO）導電玻片上，在基質涂覆后送入MALDI質譜儀中進行質譜圖的采集。在質譜圖采集之前需要設定坐標參數，將樣本網格化為多個像素點的集合，然后在目標分析物所在的質量區間內對每個像素點進行質譜圖的采集。質譜圖采集過程與MALDI MS實驗過程類似，樣本每個點中的化合物在激光照射下分別進行解吸和離子化，進而獲得每個像素點對應的質譜圖，所有像素點中的質譜圖再通過成像軟件整合為一張平均質譜圖。后續借助質譜成像數據處理軟件可以對平均質譜圖中目標分析物的相關峰進行提取和整合，整合后得到的目標分析物相對峰強度和色彩強度相對應后，便可得到不同目標分析物在樣本上的相對含量分布圖。MALDI MSI實驗得到的質譜成像圖可以清晰直觀地反映出不同化合物在樣本中的相對含量分布，且一次實驗可以同時得到多個化合物分子在樣本中的相對含量分布。

圖1 MALDI MSI實驗原理圖

2 儀器與試劑

日本電子MALDI Spiral TOF-TOF質譜儀（JMSS3000，JEOL Ltd.，Akishima，Japan）用于MALDI MSI實驗，布魯克.道爾頓公司（Bruker.Daltonics，Bremen，Germany）ImagePrep基質噴霧儀用于基質的沉降。乙腈、甲醇均為色譜純溶劑，購自默克Merck（Darmstadt，Germany）。2，5-二羥基苯甲酸（2，5-dihydroxybenzoic acid，DHB）、磷脂標準品PC（32：1）、PC（34：1）和三氟乙酸均購自Sigma-Aldrich（St.Louis，MO USA）。Direct-Q去離子水（Milford，MA，USA），18 MΩ.cm。其他試劑均為分析純，未經過進一步純化。

3 實驗流程

圖2所示為MALDI MSI實驗流程示意圖。

圖2 MALDI MSI實驗流程圖

實驗主要包括以下4個步驟：

（1）成像樣本制備。本實驗選擇兩個磷脂標準品PC（32∶1）與PC（34∶1）作為目標分析物，標準溶液采用甲醇和水作為溶劑，甲醇和水的體積比為1∶1，使用石英毛細管吸取磷脂標準溶液，分5次疊加點在ITO導電玻片上，樣品點的大小在2 mm左右，并在樣品點旁邊點上外標物用于儀器校準，然后將包含磷脂樣品點的ITO導電玻片用于后續的MALDI MSI實驗數據采集和分析。實驗中使用標準品的樣品點代替生物組織樣本，可以簡化組織的采集和冷凍切片過程，且樣品點直徑可控制在2 mm左右，使得譜圖采集時間較短，極大地節約了質譜成像實驗時間。

（2）基質溶液配制和基質的涂覆。實驗使用DHB作為基質，用體積比為80：20：0.1的甲醇、水和三氟乙酸的混合溶劑將DHB溶解，配置成7 mg／mL的溶液。基質溶液放入基質噴霧儀中采用設定好的程序進行基質的涂覆，其中基質沉積程序包括40個循環，每個循環由1 s噴涂時間、15 s孵育時間和60 s干燥時間組成。

（3）質譜成像數據采集。在數據采集前選擇相應質量數的校準文件，采用外標法進行儀器校準。校準后進行采樣范圍的選擇和參數的設定。對于MALDI MSI參數，激光重復頻率為250 Hz，累積3 000 shots（轟擊）；為了節約實驗時間，實驗的空間分辨率設定為100μm。將2 mm直徑的樣品點送入儀器后，參數設定和數據采集可以在30 min內完成。

（4）數據處理與呈現。數據采集后生成的imzML格式文件，可使用開源的成像軟件msIQuant［12］或BioMap［13］進行數據分析和處理。學生也可以自行下載這些軟件后進行學習和后續的實驗數據處理。實驗過程可以讓學生了解MALDI MSI的實驗原理，后續的數據處理可以增強學生對于軟件的學習能力和實踐創新能力。

4 實驗結果分析與討論

4.1 標準品和基質的選擇

實驗中之所以選擇用磷脂標準品制備MALDI MSI實驗樣本，主要有兩個原因：①因為MALDI MSI在不同樣本的脂質分子成像分析中具有廣泛的應用，采用磷脂標準品作為樣本可以幫助學生了解磷脂作為目標分析物時的質譜分析參數設定和研究方法，這對于學生后續科研中處理更為復雜的樣本奠定基礎；②因為磷脂分子中含有季銨鹽端，在MALDI MSI中易于得到質譜信號，且實驗中得到的結果重現性好。

在MALDI MS實驗中，成像基質的選擇對于實驗的成功至關重要，對于磷脂化合物的成像分析，本實驗中選擇了文獻報道較多的DHB作為基質［12-13］，因為該基質是適合于磷脂化合物的成像實驗，且基質的結晶較為均勻，結晶尺寸也符合成像實驗標準。

4.2 成像數據的呈現與處理

采用上述實驗方法得到的質譜成像平均譜圖如圖3所示，譜圖中顯示出了兩個磷脂標準品PC（32：1）與PC（34：1）的質子加和峰以及DHB基質的相關峰。分子質量的不同使得兩個化合物的相關峰可以清楚地被區分，另外DHB的相關峰并未在目標分析物的質量區間內產生干擾，這些都有利于后續數據的整合和處理。

圖3 磷脂PC（32∶1）與PC（34∶1）的平均質譜圖

數據采集后生成了imzML格式的文件，該文件可使用開源的成像軟件msIQuant進行成像圖的呈現。msIQuant成像軟件的下載和使用在文獻［12］中有詳細的描述。學生在得到成像數據后可以通過參考文獻進行軟件下載、安裝和使用。這不僅可以鍛煉學生閱讀和學習科研文獻的能力，也可以提高學生對于復雜譜圖數據的分析和處理能力。

數據通過格式轉換后，使用成像軟件msIQuant得到的磷脂標準品PC（32∶1）與PC（34∶1）質譜成像圖如圖4所示。圖中標準品在約2 mm直徑的樣品點中的強弱分布較為清晰，樣品點在邊緣處濃度高、中心濃度低的現象主要由于“咖啡環效應”［16］導致，在不同區域分布不均勻也與點涂樣品時的操作過程相關。

圖4 磷脂PC（32∶1）與PC（34∶1）的質譜成像圖

5 結 語

MALDI MSI技術由于具有可以在一次實驗中同時獲得多類分子的成像信息的優點，已發展為一種跨學科、應用領域廣泛的新型分子原位成像技術。MALDI MSI實驗包括組織病理切片、譜圖采集和數據的統計處理等多個步驟，同時還涉及到復雜的樣本前處理，所需實驗時間過長、操作繁瑣，因此難以在本科生教學實驗中開展，另外質譜系統穩定性和重現性等多種問題也會影響最終的實驗教學效果。本科生實驗教學需要有準確的實驗原理、簡明的實驗步驟、重現性好的實驗結果和有說服力的實驗意義，這樣才能通過實驗理論和實驗操作的學習提高學生的科研創新能力，培養學生的科研思維。為了達到上述目的，本實驗以標準品的樣品點作為模擬樣本，簡化了樣本前處理過程，實現了實驗時間可控、實驗步驟簡單、實驗重現性好的目標。學生通過該實驗可以掌握MALDI MSI原理，熟悉質譜成像實驗的步驟和大型儀器的操作方法，并學習到數據的整合和分析處理方法。