面向應用創新型本科生培養的生物化學實驗教學設計
——以GFP蛋白的表達分離純化為例

徐志霞， 孫 杰， 楊 勇， 丁 利

（海南師范大學生命科學學院，熱帶島嶼生態學教育部重點實驗室，海南省熱帶動植物生態學重點實驗室，海口 571158）

0 引 言

2015年國務院印發的《統籌推進世界一流大學和一流學科建設總體方案》文件中，對高等教育階段的人才培養提出了更高的目標［1-2］，如何培養創新型、應用型、復合型人才成為各高校著重考慮的問題［3-4］。實驗教學是高等教育的一個至關重要的模塊，是學生對理論知識和實踐技能有機結合的重要途徑，對學生創新思維和應用思維的形成具有重要的作用［5］。在雙一流的建設背景下，如何優化實驗教學體系，改革實驗教學內容，以適應學生對創新與應用的要求，成為一個重要的課題［6-7］。

生物化學實驗是生物學專業的核心課程，不僅能為學生專業課的學習打下基礎，更是學生開展生命科學研究的必備技能［8-9］。蛋白質的相關實驗，如提取、分離、純化、定量分析等是生物化學實驗中很重要的一個模塊，在這個模塊的傳統教學中存在教學形式枯燥、教學內容分散、缺乏連貫性等問題［10］，難以達到預期的課程目標。實驗課教學的成效，能否達到課程目的和目標，取決于諸多因素。其中，實驗材料的選擇，以及教學內容的設計是兩個非常關鍵的因素，直接影響學生學習本門課程的興趣以及學生創新科學思維的培養。為提高教學效果，培養具有創新性的應用型復合型人才，我院生物化學實驗教學采用新型教學模式，以綠色熒光蛋白為實驗材料，進行生物化學蛋白質模塊的教學，并以此為基礎，開展創新型設計性實驗，實現理論－實踐－創新設計的學習模式，推動培養具有創新能力的應用型復合型人才目標的實現。

1 實驗教學材料的優化

在生物化學實驗的蛋白質相關實驗中，很多高校選用的實驗材料為堿性磷酸酶、酵母蔗糖酶等［11］，這類蛋白質表達量低、看不見摸不著，教學過程枯燥，對于初學者來說實驗成功率低。為改變生物化學實驗內容的枯燥性，同時提高實驗的成功率，我院選擇綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）作為蛋白質分離純化模塊的實驗材料。GFP是一種分子量為20 kD的生物蛋白，其熒光反應只需紫外光或藍光激發即可（見圖1）。即使該蛋白未經純化，其發射的綠光也非常強，在正常室內光線下即可辨別［12］。

圖1 紫外光下綠色熒光蛋白檢驗

基于GFP蛋白易于檢測，穩定性強的特點，將GFP基因插入到pMAL-c5X載體中構建重組載體，轉入大腸桿菌E.coli BL21（DE3）菌株，表達得到重組GFP蛋白，其相對分子質量約為70 kD，N端帶有Histag6標簽，可進行親和層析實驗，同時其表達量高，實驗過程中肉眼可追蹤，在蛋白質的分離純化中是一個非常好用的材料。

2 實驗教學內容優化

2.1 重組GFP蛋白的表達

將構建好的表達載體轉化大腸桿菌E.coli BL21（DE3）菌株，挑取單克隆菌落，接種到含有50μg／mL氨芐青霉素的5 mL LB培養基中，37℃振蕩培養過夜。將該5 mL細菌懸浮液轉移到150 mL含有50 μg／mL氨芐青霉素的LB培養基中，37℃振蕩培養至OD600值為0.6后，加入終濃度為0.1μmol／L的IPTG，28℃繼續培養4 h，4 000 r／min、10 min離心收集菌體（見圖2），－20℃保存備用。

圖2 表達GFP蛋白的菌體收集

2.2 菌體破碎

用40 mL Tris-HCl緩沖液（含20 mmol／L Tris，300 mmol／L NaCl，pH8.0）重懸菌體沉淀，置于冰上進行細胞破碎。在預習實驗時，學生提出了3種破碎方案：超聲破碎法、反復凍融法和酶溶法。其中超聲破碎程序為超聲4 s，間歇6 s，持續20 min；反復凍融方法為液氮和室溫交替反復凍融3～5次；酶溶法為添加溶菌酶。3種破碎方案的效果比較如圖3所示。結果顯示超聲破碎法效果要明顯優于其他兩種方法。

圖3 不同方法的破碎效果比較

在本實驗中，學生充分發揮其主觀能動性，將理論知識應用到實驗中去。在對結果的分析中，有同學發現酶溶法破碎的菌上清液在14 kD附近有一條蛋白條帶，是另外兩種破碎方法中所沒有的，起初多數同學不清楚這個條帶是什么？經過大家查閱文獻、分析討論，確定是溶菌酶。由此，加深了同學們對大多數酶是蛋白質的認識，同時鍛煉了其認真細致觀察分析實驗結果的能力。

2.3 鎳離子金屬親和層析

選用超聲破碎法破碎菌體后，12 000 r／min，4℃離心30 min，收集上清液進行蛋白質的初步純化。重組GFP蛋白N端帶有His標簽，能特異性地結合在鎳柱上，而其他非目的蛋白結合力弱，可以用含不同濃度咪唑的Tris-HCl緩沖液進行洗脫，獲得初步純化的蛋白。本實驗采用IDA-Ni預裝重力柱，使用含50、100、150、500 mmol／L梯度濃度的咪唑洗脫液洗脫目的蛋白。將菌懸液、裂解液上清、穿透液（flow through）、不同濃度咪唑洗脫液蛋白進行SDS-PAGE電泳，從電泳結果的圖譜（見圖4）中可以分析很多信息，充分鍛煉考量學生的看圖比較分析，得到有效知識點的能力。從圖4可見，菌懸液與裂解液上清相比較，在70 kD左右有一條很粗的蛋白條帶，表明該重組GFP蛋白的表達量很高，且溶解性好。裂解液上清與穿透液相比較，穿透液中的重組GFP蛋白含量減少了很多，表明大部分目標蛋白質結合在了鎳柱上，掛柱效果好，同時非目的蛋白多數未結合在柱子上。從不同濃度的咪唑洗脫液來看，鎳柱純化效果較好，在100 mmol／L咪唑洗脫液洗脫下，目的蛋白的純度和濃度均較高，但仍有少許不同分子量大小的非目的蛋白存在，需進一步純化。

圖4 鎳離子金屬親和層析純化GFP蛋白SDS-PAGE電泳結果

2.4 離子交換層析

經預實驗得知，重組GFP蛋白的等電點在酸性范圍內，在pH8.0的Tris緩沖液中帶負電荷，因此使用DEAE弱陰離子交換柱進行離子交換層析。在本實驗中，學生可使用親和純化收集的蛋白質進行離子交換實驗，但是要經過脫鹽和濃縮處理，耗時較長，課時不允許的情況下可作為學生課后自主探索的內容。本實驗直接用超聲破碎后的蛋白溶液進行純化，采用含50、100、200、300、500、1 000 mmol／L梯度濃度NaCl的Tris-HCl緩沖液洗脫目的蛋白。SDS-PAGE電泳結果（見圖5）顯示，離子交換層析相較親和層析，純化效果不佳，但是穿透液的蛋白純度較高，非目的蛋白幾乎不可見，這也不失為提高純度的一個思路。結合親和層析的SDS-PAGE電泳圖譜來說，二者相結合可達到較為理想的純化效果。

圖5 離子交換層析純化GFP蛋白SDS-PAGE電泳結果

2.5 凝膠過濾層析

為進一步提高蛋白質的純度，采用凝膠過濾層析對鎳離子金屬親和層析純化后的蛋白進一步分離純化。將親和層析純化后的蛋白質用超濾管濃縮，得到1 mL高濃度的蛋白溶液便于上樣。從洗脫曲線（見圖6）可見，得到3個紫外吸收峰，選取主峰的第8管和第9管進行SDS-PAGE電泳檢測（見圖7），結果顯示，經凝膠過濾層析，重組GFP蛋白的純度明顯提高，達到了對目的蛋白分離純化的目的。

圖6 凝膠過濾層析洗脫曲線

3 實驗教學考核評價方式改革

經過上述蛋白質純化的一系列實驗，學生系統地掌握了蛋白質的誘導表達、細胞破碎、親和層析、離子交換層析、凝膠過濾層析、SDS-PAGE電泳等技術，具備了開展相關探究性實驗的能力。本課程考核采用開放性項目的形式進行，學生組成4～5人的團隊，在生命大分子物質的制備分離的范圍內自主選題，利用蛋白質分離純化及生物化學其他理論和操作技能開展實驗，最后成果為分離到一種純度較高的酶，并在課程結束時，團隊進行項目的PPT匯報，最終撰寫論文提交。

近年來，在生物技術專業的教學過程中，在自主考核的環節，學生的興趣和積極性都很高，選題包括了從大蒜中提取純化超氧化物歧化酶，從雞蛋清中提取溶菌酶，分離純化羅漢果蛋白酶、甘薯β-淀粉酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、馬鈴薯多酚氧化酶、豬胰蛋白酶等，此外，也包含了枯草芽孢桿菌蛋白酶的分離純化、酵母蔗糖酶的分離純化、粘質沙雷氏芽孢桿菌殺蟲蛋白的分離純化等。在這個過程中，學生不僅復習鞏固了課堂教學過程中的理論知識和實驗技術，同時鍛煉了查閱文獻、獨立思考、實驗設計、團隊協作以及撰寫論文的能力。

該考核方式從開放性項目的選題、課題設計到課題的實施、論文撰寫、匯報，均以學生為主體，實驗室搭建開放平臺，指導教師時刻關注學生的實驗動態，把控整個考核進度，充分發揮了學生的主觀能動性，調動了學生的積極性。

4 教學效果

4.1 實驗對象新穎，實驗成功率高

生物化學實驗側重于糖和蛋白質的分離鑒定，目前的主流教材實驗內容偏單一，蛋白質的分離鑒定的一系列實驗彼此間缺乏關聯，實驗材料多為堿性磷酸酶，看不見摸不著，學生實驗過程中成功率低，容易打擊學生實驗的積極性，教學效果不理想。在以“綠色熒光蛋白”為實驗對象的蛋白質分離鑒定的綜合性實驗中，實驗材料變成了能看得見的蛋白質，學生在整個實驗過程中能觀察到蛋白質的去向，不必等到全部實驗結束在SDS-PAGE凝膠上才知道實驗的成敗與否。

在綜合性實驗中，圍繞綠色熒光蛋白為同一實驗對象，將獨立的知識點連接成一條線，每個實驗內容之間是層層遞進的關系，學生能夠進行實驗數據的縱向和橫向比較，更加深入理解實驗原理，能夠根據實驗對象與實驗目的選擇合適的實驗方法，形成多維度的知識體系，達到較好的實驗效果。

4.2 促進學生個性化發展

在本綜合實驗教學模式下，學生基本功扎實，進入相關科研實驗室進行科學研究能夠迅速進入角色，通過實驗考核模式的改革，學生不再是簡單的復習就能過關，注重過程而非結果，他們能夠結合自己在研究室的科研經歷和興趣點，選擇不同的項目主題，利于學生個體差異化的發展。在國家日益提倡大學生進行創新創業訓練的環境下，很多學生都有自己的創新項目，接下來的考核中，也可以與學生自己的項目相結合，更大地發揮學生的主觀能動性，提高教學效果［13～15］。

4.3 激發學生的探究意識

在本綜合實驗模式下，不再照本宣科，而是引導學生思考，例如在鎳離子親和層析實驗中，給學生講述清楚洗脫目的蛋白的原理，采用梯度洗脫的方式，而采用何種梯度，學生可以根據自己的實驗來調整。而在蛋白質的誘導表達這一節中，因這個實驗的特殊性及時間限制，由實驗老師進行準備，課堂上只講述，學生在聽的過程中就提出，為什么采用這個溫度？IPTG為什么要這個濃度？改變這兩個條件會發生什么變化？于是有幾組同學就進行了探究，分別設置溫度梯度和IPTG濃度梯度來進行探究，最后呈現的效果是非常好的，學生對蛋白質誘導表達的理解也更為深刻了。

5 結 語

通過以綠色熒光蛋白為實驗材料的蛋白質分離純化這個綜合性實驗項目以及以本項目為基礎的實驗考核方式的改革，大大提高了學生學習探究的興趣，提高了學生學習的自主性，同時也極大地提升了學生創新研究的能力。自2015年本綜合性實驗項目在生物技術專業實施以來，經過不斷摸索，教師和學生的默契度不斷提升，實驗體系已逐漸成熟，取得了較好的教學效果，修過該課程的同學進入科研實驗室能很快進入角色。至于實驗考核逐漸過渡到學生自己參與的項目驅動式的考核方法還需要在實踐中不斷地摸索改進。