擬南芥MAX2蛋白功能研究進展

呂天曉,劉瓊銳,范甜,周玉萍,田長恩

(廣州大學生命科學學院，廣東省植物適應性與分子設計重點實驗室，廣州 510006)

獨角金內酯(strigolactone,SLs)是一種丁烯內酯類化合物，近年來被確定為一類新型的植物激素[1–2]。SLs 具有刺激寄生植物種子萌發、促進叢枝菌根真菌與植物共生[3]，抑制植物的地上分枝，調控根系發育等多種重要的生物學功能。SL 途徑相關基因的突變，往往會導致植物株型的矮小，并同時伴有多分枝的表型。利用擬南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)、豌豆(Pisum sativum)、矮牽牛(Petunia hybrida)等不同植物品種作為研究材料，從矮小多枝或多分蘗的突變體植物中先后克隆到了20 多個與SL 途徑相關的基因。其中MAX1、MAX3和MAX4為SL 合成途徑主要成員，而MAX2(more axillary growth 2)則為信號傳導途徑的核心因子[4]。由于max2突變體表現出多種明顯的發育異常表型，使得MAX2 受到了廣泛而深入的研究，其多樣化的功能逐步得到揭示，大量的研究表明，MAX2 在多種植物激素信號交叉互作中扮演著重要的角色。本文對MAX2 的蛋白結構、已知功能及相關機理進行了簡單的總結和闡述，展示了MAX2 研究進展的概貌，以期為進一步揭示MAX2 作用的分子機制及其在不同激素信號途徑中的角色和功能提供理論參考，同時針對作物抵御生物和非生物脅迫的育種改良提供一定的理論指導。

1 MAX2 的蛋白結構

MAX2編碼具有693 個氨基酸的F-box蛋白,其中包含1 個F-box 結構域，一段富含18 個亮氨酸殘基的重復序列LRR (leucine rich repeat)，以及1 個鋅指結構域[5]。在擬南芥中F-box 蛋白是一類擁有700 多個成員的龐大家族，與另外2 個蛋白Skp1 (Sphase kinase-associated protein1)和Cullin 構成SCF(Skp1-cullin- F-box)泛素復合體，其中Skp1 和Cullin是復合體的基本骨架，而F-box 蛋白則根據其C 末端不同的二級結構，如亮氨酸拉鏈、螺旋-環-螺旋(helix-loop-helix,HLH)、鋅指結構域等來特異地招募不同的蛋白質底物，通過泛素/26S 蛋白酶體系統(UPS,ubiquitin-26S proteasome system)將泛素化修飾的底物蛋白降解[6]。F-box 蛋白的底物往往是某一信號途徑的抑制子，被降解后則開啟信號通路，因此結合底物的不同，決定了F-box 蛋白功能的不同。而同一F-box 蛋白結合的底物不一定是唯一的，因此可能在植物生長發育，以及對生物和非生物脅迫反應等各個方面均發揮重要的功能[5]。

2 MAX2 的生物學功能

2.1 MAX2 限制植物的壽命

擬南芥MAX2 最早被發現的功能是延遲葉片衰老。Oh 等[7]從3 萬多株EMS 誘變的擬南芥M2代幼苗中篩選到4 株在黑暗誘導下葉片壽命延長的突變體，分別命名為ore1(oresara1)、ore2(oresara2)、ore3(oresara3)和ore9(oresara9)，“oresara”在韓語中是長壽的意思，這里的ORE9 與后來在分枝研究中鑒定的MAX2 為同一蛋白。該課題組對ore9突變體的進一步研究表明，ore9的葉片在年齡依賴的自然衰老和激素調節(ABA、MeJA、乙烯)的衰老過程中都表現出壽命延長的特征。通過圖位克隆的方法，ORE9基因編碼含有693 個氨基酸的多肽，其中包含1 個F-box 基序和1 段富含18 個亮氨酸的重復序列LRR,第327 個氨基酸突變使編碼提前終止,導致其功能的喪失。ORE9 的F-box 基序與植物SCF復合物的組成部分ASK1 (Skp1-like 1)相互作用，這表明ORE9 在擬南芥中通過泛素蛋白酶水解途徑降解延緩葉片衰老所需的靶蛋白，從而限制葉片壽命[5]。ore9突變體對過氧化氫等氧化脅迫的耐受力增加，并且這種增強的反應與植物葉片的壽命有關[8]。Yan 等[9]首次驗證了水稻中的D3基因(MAX2同源基因)在調控水稻葉片衰老中的作用，與擬南芥max2相似,d3突變體在黑暗誘導的衰老進程和過氧化氫誘導的細胞凋亡中也出現延遲的表型，表明水稻中的D3 蛋白與擬南芥中的ORE9/MAX2 具有相同的功能,可參與調控葉片的衰老和細胞的凋亡。

ORE3/EIN2 (ethylene insensitive 2)和EIN3 是乙烯信號途徑重要的響應因子。2016年，Zhang 等[10]報道在MeJA 誘導下，MPK6 (mitogen-activated protein kinase 6)通過直接激活ORE3/EIN2 和EIN3 促進乙烯反應信號基因的表達,同時MPK6 增強細胞核中EIN3 的積累，EIN3 與ORE9啟動子結合，并增加ORE9的mRNA 水平,這揭示MeJA 誘導下，包括MPK6-ORE3/EIN2-EIN3-ORE9/MAX2 在內的信號通路對調節葉片衰老的影響。

2.2 MAX2 抑制植物的分枝

Stirnberg 等[11]通過篩選擬南芥突變體庫，發現了3 個初級分枝密集的株系max1-1、max2-1和max2-2,除多分枝表型外，3 個株系的葉片形狀也受影響,其中max2-1和max2-2株系出現下胚軸和葉柄的伸長。圖位克隆表明MAX1和MAX2為2 號染色體上2 個不同的等位基因，其中MAX2與Oh 等[7]克隆到的能夠限制擬南芥葉片壽命的ORE9為同一基因，其第581 和585 位氨基酸變異分別導致max2-1和max2-2的異常表型，MAX2 通過控制腋芽分生組織抑制基原細胞的形成，從而抑制擬南芥的分枝。過量表達缺失F-box 結構域的MAX2 蛋白不能恢復max2的突變表型，證明MAX2 調控植物分枝的過程涉及泛素化途徑，MAX2 可能通過UPS 系統降解某種能夠激活腋芽生成的未知蛋白來抑制分枝的形成[12]。Ishikawa 等[13]分析了5 個植株變矮、分蘗增多的水稻突變體d3、d10、d14、d17和d27株系，認為分蘗矮化突變體在控制分蘗芽休眠以抑制芽活性方面發揮了作用，基于圖位克隆的D3基因包含4 個外顯子和3 個內含子，具有F-box 結構域和NRR 序列，與擬南芥MAX2/ORE9高度同源，其第154 個氨基酸處插入轉座子導致氨基酸序列改變并形成終止子，這表明單子葉和雙子葉中控制腋芽活性的機制是保守的。自此之后，D3 控制水稻分蘗的功能得到了廣泛深入的研究。

BES1 (bri1-EMS-suppressor 1)是BR 信號通路中的正調節因子，作為下游轉錄因子直接調節BR 反應基因的表達，Wang 等[14]報道BES1 及其同系物可以與MAX2 相互作用，作為MAX2 的底物被26S蛋白酶系統UPS 降解，同時BES1 及其同系物的表達降低可以顯著抑制max2突變體的多分枝表型,表明BES1 是MAX2 的直接靶標并作為SL 信號通路的負調節因子促進擬南芥地上部分枝。

在水稻中，利用1 個對SL 不敏感的矮稈突變體d53克隆到D53基因，該基因編碼D14-SCFD3泛素復合體的底物并作為SL信號的阻遏物起作用。用人工合成的獨腳金內酯類似物GR24 處理后，D53通過26S 蛋白酶體降解。同時，D53 可以與轉錄共抑制因子TPR (topless-related protenins)相互作用共同調控水稻的分蘗表型[15–16]。在擬南芥中，3 個D53類似蛋白SMXL6、SMXL7 和SMXL8 (suppressor of more axillary growth2-like 6,7,8)也在控制腋芽分枝方面發揮相似的功能，smxl6smxl7smxl8三突變體抑制max2和SL 缺陷突變體max3的高度分枝表型。外源施用SL 類似物rac-GR24 導致SMXL6,SMXL7和SMXL8 泛素化降解。該過程同樣依賴于MAX2與D14 形成的泛素復合體。同時SMLXs 通過轉錄共抑制子TPR2抑制分枝相關轉錄因子BRANCHED1的表達，從而調控側芽生長[17]。研究表明[18]，D3/MAX2 蛋白的C 末端螺旋結構(C-terminal helix,CTH)在SCFD3/MAX2泛素復合體招募D14、泛素化D53/SMXLs 以及后續的蛋白質降解中都發揮著關鍵的調節作用，利用CRISPR-CAS9 基因編輯去除了CTH的植物，其SL 信號的轉導嚴重受損，這從蛋白質構象的層面解析了MAX2 功能，為科研人員提供了全新的研究思路。

2.3 MAX2 影響幼苗的光形態建成

2007年，通過遺傳篩選分離到1 個在連續紅光、遠紅光和藍光下，下胚軸變長、子葉變小，并對紅光和遠紅光誘導的種子萌發不敏感的T-DNA 突變體pps(pleiotropic photosignaling)。基于圖位克隆和候選基因相結合的方法，定位到PPS與MAX2/ORE9為同一個基因，至此已從3 種不同的遺傳篩選中分別定位到了相同的基因，可見PPS/MAX2/ORE9功能的多效性，推測在植物整個生命周期的不同發育階段，MAX2 可能調控多個靶點，以優化植物的生長發育[19]。MAX2 調節GA 和ABA 的生物合成,以優化種子在光照下的萌發，max2種子在萌發反應中對GA 低敏感，對ABA 高敏感。與野生型相比,max2種子中GA 生物合成基因的表達下調，而GA分解代謝基因的表達上調，max2種子中ABA 生物合成和分解代謝基因的表達均上調。用生長素運輸抑制劑NPA 處理，max2幼苗中生長素運輸的增加有助于下胚軸延長的表型。以上這些表型都僅限于max2調控，而SL 合成途徑突變體max1、max3和max4在種子萌發和幼苗去黃化方面沒有任何缺陷。因此,MAX2 調節多種激素途徑以影響光形態發生[20]。

Wang 等[21]報道，人工合成的SL 類似物GR24 4DO 增強SL 受體DWARF14 (D14)和SMXL2 的互作，而KAR 的替代物GR24ent-5DS 誘導KAR 受體KARRIKIN INSENSITIVE2 (KAI2)與SMAX1 和SMXL2 的互作，2 條信號都引發SMXL2 的泛素化降解。SMXL2 在下胚軸對GR244DO 的反應中至關重要，而在對GR24ent-5DS 的反應中SMXL2 與SMAX1 存在功能的冗余。同時，2 條信號都通過SMXL2 誘導D14-LIKE2 和KAR-UP F-BOX1 的反應，這揭示了SL 和KAR 在調控植物下胚軸伸長中重要的信號交匯機制。

2.4 MAX2 促進種子的萌發

Karrikins 是從植物燃燒后產生的煙中分離得到的一種丁烯內酯類化合物，其結構與SLs 相似，能夠刺激種子的萌發，在多個方面影響幼苗的早期發育。Nelson 等[22]利用γ射線輻照擬南芥Ler (landsberg erecta)，從M3 代群體中篩選到7 株對KAR1誘導的種子萌發不敏感的突變體株系，其中2 個突變體kai1-1和kai1-2具有多種相同的表型，包括腋芽分枝增加，花序高度縮短，延遲衰老，葉卷曲和延長的下胚軸，同時kai1-1和kai1-2對KAR1、KAR2及人工合成的獨腳金內酯類似物GR24 誘導的種子萌發沒有任何反應。這些表型與擬南芥突變體max2/ore9/pps完全相同。對kai1-1和kai1-2突變體中的max2基因進行測序,揭示了2個獨特的等位基因出現4 bp 插入和4 bp 缺失，導致編碼693 個氨基酸的MAX2 蛋白在第248 和66 個密碼子之后發生移碼突變，現在分別將這2 個突變體稱為max2-7和max2-8。Karrikins 和GR24 在種子萌發、幼苗的光形態建成和早期發育相關基因的表達上具有相同的表型，但不同的是Karrikins 并不能抑制擬南芥和豌豆的分枝，表明SLs 和Karrikins 這2 條不同化學路徑的作用機制不完全相同，但2 種信號的傳導都需要F-box 蛋白MAX2[22]。Waters 等[23]進一步揭示，D14 蛋白是植物對SL 反應所必需的，而D14旁系同源基因KAI2 (KARIKIN INSENSITIVE 2)則是karrikins 信號所必需的，D14 和KAI2 的表達模式與植物發育不同階段對SLs 或karrikins 的反應能力一致，2 者同屬于α/β水解酶家族成員，結構相似，但d14和kai2突變體卻表現出依賴于max2的不同表型，表明MAX2 在2 種信號中發揮不同作用以提高植物對環境的適應性。

Stanga 等[24]通過篩選突變抑制子鑒定了1 個突變體smax1-1max2-1，其能夠恢復擬南芥max2種子萌發及苗期光形態建成，但不影響側根形成、腋芽分枝以及衰老延遲表型，經圖位克隆確定smax1(suppressor of MAX2 1)抑制max2突變表型的功能為5 號染色體At5g57710 第292 位氨基酸突變形成終止密碼子所致。Zhou 等[16]證實SMAX1 為水稻SL 信號調控分枝表型的底物蛋白D53 在擬南芥中的同源基因。Struk 等[25]通過串聯親和純化的方法篩選到1 個新的擬南芥MAX2 互作蛋白PAPP5(phytochrome-associated protein phosphatase 5)，其與KAI2 結合調控KAR/KL 介導的次優條件下種子萌發和幼苗發育進程，此外，磷酸肽富集試驗表明,PAPP5 可能在體內以不依賴rac-GR24 的方式去磷酸化MAX2，從而控制KAR/KL 相關表型[25]。

2.5 MAX2 介導非生物脅迫反應

max2突變體對干旱、ABA 抑制的種子萌發、NaCl、葡萄糖和甘露醇等非生物脅迫超敏感[4,26],這可能與max2對干旱和ABA 誘導的氣孔閉合敏感度降低，以及角質層厚度明顯變薄有關。與max2明顯不同，獨腳金內酯合成途徑的突變體max1、max3和max4并不參與這些反應過程，表明這些反應主要不是由SL 信號所介導，而是通過SL 信號傳導途徑的關鍵調節因子MAX2 參與到ABA 或其他激素信號的調控中而得以實現的。

水稻D53基因在擬南芥中的同源基因SMXL6/SMXL7/SMXL8參與干旱反應，與野生型相比,smxl6-smxl7smxl8三突變體耐旱性顯著增強，失水量降低，角質層變厚,花青素生物合成增加，而且對ABA 誘導的氣孔閉合及萌發后的ABA 反應超敏感，這些表型剛好與max2-1突變體相反，進一步證明了ABA和SL 信號通路在調節植物對干旱等非生物脅迫的反應中存在交叉互作，而SMXL6，SMXL7 和SMXL8作為SL 介導的植物分枝信號途徑中SCFMAX2泛素復合體的底物蛋白，在ABA 信號傳導中同樣發揮重要功能[27]。最新的研究表明，擬南芥SMAX1 可以與D14 相互作用，在滲透脅迫的觸發下，通過SL 信號途徑被降解，從而起到在脅迫條件下保護植物的作用[28]。

2.6 MAX2 增強植物抗病性

Piisil?1 等[29]報道max2突變體對腐生型細菌—肉食果膠桿菌(Pectobacterium carotovorum)敏感性增強，推測這種表型可能與max2的氣孔導度增加，對活性氧抗性減弱，以及激素失衡有關。而max2、d14及SL 合成途徑的max3和max4突變體對Pseudomonas syringaeDC3000 的反應更加敏感，在應對Pst DC3000的反應中，max2突變體內積累大量的水楊酸，表明SL 并不是防御反應基因表達的主要調節子，MAX2 可能是通過其他未知途徑激活SA和ABA 信號共同調控植物的防御反應[30]。與野生型植物相比，max2突變體的內源水楊酸含量和水楊酸反應基因的表達水平較低。在野生型和獨腳金內酯生物合成缺陷突變體中，獨腳金內酯類似物GR24 能夠增強抗病性。在野生型植物接種病原菌之前，GR24 處理并不能誘導防御相關基因的表達；然而，在感染病原菌后水楊酸反應相關的防御基因被迅速誘導。這表明SLs 在水楊酸介導的植物抗病反應中具有重要影響[31]。

2.7 MAX2 影響根系發育

與野生型(WT)相比，max2-1、max3-11和max4-1突變體側根密度明顯增加，表明內源SLs 負向控制側根的形成。外源施用10–8mol/L 的GR24，可以降低max3-11和max4-1的側根密度，表現與WT相近，但GR24 處理并不影響max2-1的側根數量；同時GR24 能夠促進野生型、max3-11和max4-1根毛的伸長，而同樣對max2-1沒有影響,這表明MAX2 在SL 介導的根系發育調控中發揮關鍵的信號傳導功能[32]。進一步的研究揭示了3 種植物激素SL、Auxin 和ET 在調控根毛伸長中的相互作用機制，其中SLs 和乙烯通過共同的途徑調節根毛伸長，乙烯對SLs 起上位作用，SL 對根毛的影響依賴于乙烯的合成。生長素反應對于SL 信號來講不是必需的，但生長素增強了根毛對SL 的反應，表明SL和生長素通過不同的途徑調節根毛的伸長，并且乙烯在SL 和生長素途徑之間形成了交叉互作[33]。但最近的研究證明[34]，先前歸因于SL 信號對擬南芥根系發育的大多數影響實際上是由KAI2 信號通路介導的。由于KAI2 和D14 分別被鑒定為Karrikin和SL信號的受體，2條信號途徑的功能匯集于MAX2,利用Karrikin和SL合成及信號途徑突變體證明,D14和KAI2 共同調節側根密度，但只有KAI2,而非D14能夠調節根毛的發育，不僅如此，KAI2 信號還能調節根的傾斜、卷曲以及根的直徑，而這一過程依賴于水稻D53 在擬南芥中的同源蛋白SMXL1 和SMXL2，而被確定為SL 介導的擬南芥分枝信號的底物SMXL6、SMXL7、SMXL8 則可以影響側根的形成，這表明KAI2 信號通路是擬南芥根毛和根發育的一個重要的調節器，并為研究SL 和Karrikin的激素信號通路如何調節不同表型的分子機理奠定了重要基礎。

3 結語

植物的一生只能固定在一個地方，為了應對生長發育過程中，來自體內、外環境的各種刺激和挑戰，植物進化出了完善而精密的激素調控網絡，包括Auxin、GA、SA、JA、ABA、ET、CK、BR、SL、Karrikin 等，彼此之間相互協調，相互依賴，共同作用促使植物適應不斷變化的環境條件。因此，近年來揭示各種激素間的交叉互作機制，成為植物激素信號調控研究中最重要的研究方向[35]。F-box 蛋白作為泛素-26S 蛋白酶系統UPS 的重要組成成分，通過與不同激素信號中的底物蛋白結合，介導底物的降解，從而在激素調控的多種反應中發揮重要功能[36]。

MAX2 屬于含有33 個成員的F-box-LRR 的亞家族，該家族的一些成員已被證明是植物激素信號傳導中的重要生長調節因子，包括生長素受體TIR1[37–38]、茉莉酸受體COI1[39–40]和乙烯信號中的EBF1 和EBF2[41–42]。MAX2 分別在衰老、萌發、分枝、光形態建成4 種不同表型的遺傳篩選中被鑒定[5,11,19,22],足以證明MAX2 功能的多向性。而隨著研究的不斷深入，MAX2 更多的功能逐步被鑒定,如影響根系的發育、介導生物和非生物脅迫反應等。與其他F-box 不同，MAX2 在激素反應中的作用機制更為復雜，其功能的響應往往涉及多種不同激素調控途徑，如max2的衰老表型與ABA、ET 相關[5,10]，萌發表型與SL、Karrikin、ABA 和GA 相關[4,22–23,43],分枝表型與Auxin、SL和BR相關[14–17,44],光形態建成與Auxin、ABA 和GA 相關[20]，根的發育與SL、Karrikin 相關[32–34]，生物和非生物脅迫與SA、JA 和ABA 相關[4,26,29,31]。MAX2 還能夠影響種子的大小及愈傷的形成，可能與細胞分裂素相關[45]。可見MAX2 的重要性在于其對不同激素間交叉互作所發揮的關鍵作用，而不僅僅是最初認為的是SL 信號或Karrikin 信號的調節因子。

當然這些功能的發揮依賴于對不同信號中底物蛋白的水解，目前的研究僅鑒定了MAX2 在調控分枝表型中的蛋白底物，即SL信號的SMXL6、SMXL7、SMXL8[17]和BR 途徑的BES1 及其同源基因[14]，在下胚軸對GR244DO 的反應中起關鍵調控作用的SMXL2[21]，以及在滲透脅迫的觸發下通過SL 信號被降解的SMAX1[28]，而其他功能的底物尚未確定。是已知的這些蛋白同時發揮了不同的功能，還是有其他未知的組分參與了這些過程還有待進一步的發掘與證實，因此識別SCFMAX2的蛋白質靶標是未來研究的一個關鍵領域，將為全面揭示MAX2 的多種功能及植物激素信號調控網絡的作用機理奠定基礎，并為農作物的遺傳育種提供可靠的理論指導。