膽囊收縮素對小腸I 細胞及胰腺細胞和小鼠胰腺消化酶儲備的影響

徐曉晴，邱帥，陳喜娟，胡立娟，李秋菊，張大鵬，王豐

（1.天津醫科大學研究生院，天津 300070；2.天津市南開醫院中西醫結合急腹癥研究所，天津 300100）

食糜進入十二指腸和近段空腸后，食糜中的脂肪和蛋白分解物會刺激腸黏膜中的I 型內分泌細胞釋放膽囊收縮素（cholecystokinin，CCK）。循環中的CCK 可刺激胰腺腺泡細胞向胰液中分泌消化酶，也使胃排空暫停并使膽囊收縮和十二指腸壺腹舒張，使膽胰液進入腸腔[1]。屆時，胰液中的蛋白酶會抑制I 細胞的CCK 分泌，使CCK 的上述效應停止。而當這些食糜離開上段小腸后，新一輪的胃排空和CCK分泌開始，CCK 介導的效益再度出現；如此循環往復直至胃內容被全部排空[2]。除調節消化吸收外，CCK 還促進胰腺的正常生長，也參與胰腺癌的發生、發展[3-7]。飲食或手術可提高CCK 的基礎分泌水平和血濃度，持續高循環水平的CCK 經受體（CCKR）介導使其靶細胞長期處于活躍狀態[8]，而CCK 的長期刺激能否改變胰腺中消化酶的構成還不清楚。胰膽轉流術（pancreatobiliary diversion，PBD）因將胰膽液引流到遠端小腸，移除了胰蛋白酶對近段小腸CCK 分泌的抑制，從而造成慢性高CCK 血癥。PBD 是CCK 研究的重要模型[3-7]，過去僅在大鼠和倉鼠體內實現，近期，小鼠的PBD 模型成功建立[9]。本實驗溯源小鼠PBD 對十二指腸I 細胞的分泌狀態、胰腺細胞及消化酶含量影響。

1 材料與方法

1.1 動物分組及處置 雄性Balb/C 裸鼠40 只購自北京華阜康生物科技，4 周齡，體重14~16 g。飼養于SPF 級動物房，12 h/12 h 晝夜循環光照，自由攝食、飲水。在適應期結束后，隨機分為胰膽轉流術組（PBD 組，n=20）和假手術組（SO 組，n=20）。術前用三溴乙醇麻醉小鼠，PBD 組手術經上腹部正中切口開腹暴露十二指腸，以膽總管（含主胰管）匯入十二指腸處為標志，在其近口側4 mm 和遠口側4 mm 兩處橫斷十二指腸，封閉游離腸段一端，另一端與末端回腸行斷側吻合，十二指腸剩余部游離端用端端吻合再建。SO 組則橫斷十二指腸和回腸的兩處，進行再吻合[9]。PBD 組或SO 組術后20 d 麻醉下處死小鼠；PBD 組剩余小鼠15 只，而20 只SO 組鼠則全部存活。取內眥血分離血漿后頸脫位處死小鼠，開腹取十二指腸，放入10%多聚甲醛中固定；取胰腺稱重，將一部分放入10%多聚甲醛固定，余部置-80℃保存。

1.2 酶聯免疫吸附法測定 用上海信帆公司的CCK 放免檢測盒。取凍存的胰腺組織放入PBS 液中，機械研磨制成勻漿，離心（5 000×g，10 min）取上清。用檢測試劑盒測定胰蛋白酶原、胰脂酶和胰淀粉酶。小鼠胰脂肪酶酶聯免疫吸附測定試劑盒（E-ELM2448c）產自武漢伊萊瑞特生物科技公司，胰蛋白酶測試盒（A080-2）產自南京建成生物工程研究所，淀粉酶ELISA 檢測試劑盒（LP-M06531）產自上海嵐派生物科技有限公司。

1.3 免疫組織化學法檢測 石蠟包埋十二指腸和胰腺組織，制成4 μm 厚切片。免疫組化的工具和試劑包括ABC 免疫組織化學染色試劑盒（PK-6200，Vector laboratories，Burlingame，CA，USA）、DAB 辣根過氧化物酶顯色試劑盒（DA1015，solarbio，北京）、CCK抗體（DF8515，Affinity，USA）、CCK1R 抗體（orb156289，biorbyt，CA，USA）和增殖細胞核抗原（PCNA）抗體（#AB92552，Abcam，北京）。以抗CCK 抗體的免疫組化來標示I 細胞[10-11]，每張切片選取5個連續視野觀察，兩名研究人員在未知分組情況的條件下用Image J 調節照片的色彩閾值量化十二指腸中的I細胞陽性區域，計算腸道CCK 陽性區域在總視野面積中的占比；在胰腺組織中計數表達CCKR 或PCNA 的細胞數目。

1.4 統計學處理 采用SPSS 22.0 統計軟件，符合正態分布的計量資料以±s 表示。兩組間均數比較采用兩獨立樣本均數t 檢驗，多組間比較采用完全隨機設計資料的單因素方差分析，不符合正態分布的計量資料，則采用相應的非參數秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組胰腺I 細胞增殖及血漿CCK 水平 如表1 所示，PBD 組胰腺重量明顯大于SO 組（P＜0.05），差異有統計學意義；且PBD 組的CCK 血漿水平也高于SO 組（P＜0.01），差異有統計學意義。

表1 PBD 對小鼠的影響（±s）Tab 1 The effect of PBD on mice（±s）

表1 PBD 對小鼠的影響（±s）Tab 1 The effect of PBD on mice（±s）

注：SO 組：假手術組；PBD 組：胰膽轉流術組；CCK：膽囊收縮素；CCKR：膽囊收縮素受體；PCNA：增殖細胞核抗原

?指標 SO 組（n=20） PBD 組（n=15） t P胰腺重量（mg） 273.81±19.43 364.82±32.93 2.51 ＜0.05血漿CCK（pmol/L） 1.83±0.05 3.85±0.13 16.59 ＜0.01 I 細胞區域占比（%） 5.54±1.24 14.42±3.72 5.04 ＜0.01 CCKR 陽性細胞（‰） 24.41±3.16 49.68±3.90 5.08 ＜0.01 PCNA 陽性細胞（‰） 13.26±1.67 44.62±3.92 8.05 ＜0.01

2.2 兩組I 細胞區域比較 如圖1 所示，PBD 組I細胞區域占比明顯高于SO 組（P＜0.01），差異有統計學意義（表1）。

圖1 兩組I 細胞免疫組化結果（400×）Fig 1 Immunohistochemical of I cells in two groups（400×）

2.3 兩組CCKR 受體比較 如圖2 顯示，PBD 組CCKR 的表達明顯較SO 組增強（P＜0.01），差異有統計學意義（表1）。

圖2 兩組CCKR 的表達（400×）Fig 2 The expression of CCKR in two groups（400×）

2.4 兩組PCNA 比較 如圖3 所示，PBD 組的PC－NA 陽性率明顯高于SO 組（P＜0.01），差異有統計學意義（表1）。

圖3 兩組PCNA 的表達（400×）Fig 3 The expression of PCNA in two groups（400×）

2.5 兩組消化酶含量比較 如表2 所示，與SO 組相比，PBD 組胰蛋白酶原和胰脂酶的濃度升高（均P＜0.05）；而淀粉酶的水平雖有所上升，但差異無統計學意義（P=0.56）。上述結果與胰腺重量進行整合計算消化酶在胰腺中的總量時，發現與SO 組相比，PBD 組的結果均高于SO 組（均P＜0.05）。

表2 兩組胰腺消化酶比較（±s）Tab 2 The concentrations of pancreatic digestive enzyme in two groups（±s）

表2 兩組胰腺消化酶比較（±s）Tab 2 The concentrations of pancreatic digestive enzyme in two groups（±s）

注：SO：假手術組；PBD：胰膽轉流術組

指標 SO 組（n=20） PBD 組（n=15） t P胰蛋白酶原濃度（U/μg） 8.88±0.99 18.64±2.27 4.31 <0.01胰脂肪酶濃度（ng/g） 胰淀粉酶濃度（U/ng） 24.95±1.43 29.96±1.90 2.15 <0.05 1.19±0.14 1.32±0.16 0.60 0.56全胰蛋白酶含量（104 U/pancreas） 7.43±1.01 12.44±1.91 2.49 <0.05全胰脂肪酶含量（ng/pancreas） 7.19±0.73 9.61±0.98 2.02 <0.05全胰淀粉酶含量（103 U/pancreas） 0.74±0.53 1.28±0.74 2.53 <0.05

3 討論

大鼠和倉鼠的PBD 是CCK 研究的經典模型[3-7]。近期，PBD 模型在小鼠體內成功建立[9]。這一模型的建立，使PBD 可以和一些常見小鼠的模型（如轉基因鼠和裸鼠）結合，以深入研究CCK 在一些生理、病理狀態下的調節作用[12-13]。在眾多的PBD 研究中，“PBD 后I 細胞是否有反應性增生”這一問題在此前一直未被涉及。本實驗結果中，PBD 術后20 d小鼠所表現出的高CCK 血癥及其在胰腺中引發的各種改變，其起因僅來自I 細胞的高分泌狀態，也來自I 細胞群落的代償性增生，說明代償的快速和高效。

研究顯示，由PBD 導致的高CCK 血癥對胰腺生長具有刺激作用，但在這些研究中，CCKR 的結果卻缺如[4-5]。此次PBD 對胰腺生長的刺激作用與其對胰腺CCKR 表達的刺激同時發生，說明該受體介導了PBD 對胰腺細胞增殖的刺激。

Axelson 等[4]報道，早期PBD 手術可使胰蛋白酶濃度升高，但不提高胰淀粉酶的分泌能力；Hara 等[14]同樣報告了PBD 可降低胰淀粉酶活性，F?lsch 等[1]的研究中，胰蛋白酶和胰淀粉酶水平可提高。本研究中發現高CCK 血癥能夠增加胰腺中胰蛋白酶原和脂肪酶的濃度，但不顯著影響淀粉酶。CCK 能選擇性地增加胰腺蛋白酶和脂肪酶的豐度但不顯著改變淀粉酶的豐度，這一結果提示胰腺中不同的消化酶是以一種分隔的方式儲備的[15]。這一分隔既可發生在細胞水平，也可發生在亞細胞水平。例如，不同的腺泡細胞可富含不同的消化酶，而富含胰蛋白酶和脂肪酶的細胞又較富含淀粉酶的細胞更容易對CCK 的刺激做出反應。抑或，不同的消化酶可在同一細胞中富集于不同的分泌顆粒中，當CCKR 被激活后，細胞優先把富含胰蛋白酶和脂肪酶的分泌顆粒排放到細胞外。值得注意的是，CCK 對胰蛋白酶和脂肪酶的刺激與食糜中的蛋白和脂肪刺激I 細胞CCK 分泌是一致的，促使其在進食后狀態完成CCK分泌的正反饋。

本研究利用小鼠PBD 造成的高CCK 血癥發現，CCK 能選擇性地增加胰腺中胰蛋白酶原和胰脂肪酶的儲備，并證實持續的CCK 高分泌伴隨著I 細胞群落的增大。在后續的研究中，鑒于內源性CCK的異常表達與胰腺生長及消化酶分泌相關，將進一步用以研究與飲食及肥胖相關的胰腺癌發展機制。