慢性炎癥在X 射線誘發恒河猴卵巢組織持續損傷中的潛在作用

周瑩，杜湧瑞，Mary B.Zelinski，王建梅

（1.天津醫科大學第二醫院計劃生育科，天津 300211；2.美國俄勒岡健康與科學大學生殖科學部，俄勒岡 97006）

放射治療作為癌癥治療的主要手段之一，其性腺毒性，特別是對年輕女性患者卵巢功能的損傷，嚴重影響該人群治療后生殖健康和生活質量[1]。研發體內卵巢保護劑以預防放射治療后早發性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）或卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）逐漸成為研究熱點。目前的實驗研究中多為對嚙齒動物的研究，且主要關注輻射暴露對卵巢功能的早期影響[2-4]，而在非卵巢組織中的研究顯示，輻射暴露后會激活機體免疫系統，尤其是激活的巨噬細胞，可釋放促炎細胞因子和趨化因子，誘發級聯炎癥，持續性損傷組織細胞[5-6]，而卵巢輻射暴露后炎癥是否持續存在以及其對卵巢的影響目前尚不明確。本研究以經X 射線直接照射的非人靈長類動物恒河猴卵巢組織及其血液標本為研究對象，觀察其免疫細胞標志物及血清炎性因子表達情況，探討靈長類動物卵巢X 射線暴露后是否存在慢性炎癥以及其對卵巢功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 14 只月經周期規律的健康雌性SPF 級恒河猴，年齡8～14 歲，體重6.2～7.5 kg。清潔級飼養，室溫22℃，自由食水。恒河猴飼養嚴格按照NIH《實驗動物護理和使用指南》進行，所有實驗方案均經過動物保護和使用委員會批準。隨機分為3 組：假照射（Sham）組（n=8）、卵巢照射（ovarian x-irradiation，OXI）組（n=3）和X 射線照射+FTY-720（免疫抑制劑）（FTY-720）組（n=3）。

1.1.2 主要試劑和儀器 賦形劑（以下簡寫為PET）：30% PEG-2000（CAS474922-26-4，美國Cayman Chemical 公 司）、60% 無 水 乙 醇（Ethanol）、10%Tween-20（CAS9005-64-5，美國圣克魯斯生物技術公司）。FTY-720（CAS162359-55-9，美國Cayman Chemical 公司）。4%多聚甲醛固定液-PBS，單核細胞趨化蛋白（MCP）-1 單克隆抗體（MA5-17040），MCP-1（88-7399-86）、白細胞介素（IL）-6（BMS213HS）ELISA 試劑盒均購自美國Invitrogen 公司。CD68 單克隆抗體（sc-20060）購自美國圣克魯斯生物技術公司。CD-11b 單克隆抗體（ab133357）、辣根酶標記抗鼠IgG（ab6728）、辣根酶標記抗兔IgG（ab6721）、正常山羊血清（ab7481）均購自英國Abcam 公司。VECTASTAIN Elite ABC 試劑盒購自Vector Labs 公司。蘇木素染液（KGA223）、DAB 顯色液（KGP1045-20）均購自凱基生物科技有限公司。微滲透壓泵購自美國Durect 公司。Phillips 324kVp 直線加速器購自德國飛利浦公司。

1.2 方法

1.2.1 微滲透壓泵的植入 每只恒河猴的一側卵巢已被切取用以提供卵巢結構及卵泡動力學基線信息，另一側卵巢通過手術將一端帶有21 g 針頭的導管移入腹腔，并將針頭插入到卵巢中心，接口處進行縫合并固定于卵巢韌帶，導管另一端與恒河猴胸腔皮下植入的微滲透壓泵相連，Sham 組和OXI 組泵的儲液器內為溶劑PET，FTY-720 組中為PET+0.2 mmol/L FTY-720，均以10 μL/h 的速度持續泵注。

1.2.2 卵巢體外X 射線直接照射 卵巢內泵注1 周后，靜脈麻醉恒河猴，仰臥位固定，逐層打開腹腔，取出微滲透壓泵、導管后，止血鉗鉗夾卵巢韌帶并保留卵巢血管蒂，將卵巢移出腹腔，置于腹側外表面并用溫熱無菌生理鹽水紗布覆蓋，然后對OXI 組和FYT-720 組卵巢進行13 min 的X 射線照射，總劑量為15 Gy，身體其余部位用鉛板覆蓋，Sham 組卵巢不照射，僅于體外暴露相同時間，操作結束后將卵巢復位并縫合。

1.2.3 取材 照射結束第3 個月和第9 個月，采集每只恒河猴外周血，血清分離后于-80℃凍存；照射結束后第（316±7）天，于Sham 組恒河猴卵巢早卵泡期（月經周期第2～4 天）取材卵巢組織，并立即置于4%多聚甲醛-PBS 溶液中，4℃固定，常規脫水透明制作蠟塊后，進行5 μm 厚度連續切片。

1.2.4 免疫組織化學法檢測卵巢組織MCP-1、CD11b 和CD68 的表達 選取切好的卵巢組織切片，65℃烤片2 h 后，常規脫蠟脫水，微波爐修復抗原，滅活內源性過氧化物酶，血清封閉；滴加稀釋一抗（MCP-1 抗體：1/5 000；CD68 抗體：1/200；CD11b抗體：1/4 000），陰性對照為PBS 溶液，4℃過夜，按照二抗說明書滴加二抗，PBS 洗凈后行DAB 顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。使用Olympus BX40 倒置顯微鏡和Olympus DP72 成像系統在相同光照條件下進行拍攝并觀察染色結果。CD11b、CD68 陽性細胞的胞漿或胞膜呈棕黃色或棕褐色顆粒狀。在盲法分析中，由2 位研究者在每個標本的隨機5 個視野內評估卵巢切片CD11b、CD68 陽性細胞的數量，最后取均值用于統計。

1.2.5 ELISA 法檢測恒河猴血清中MCP-1、IL-6 表達水平 預先將ELISA 試劑盒置于室溫30 min，取出凍存于-80℃的血清樣本冰上融化后，嚴格按照ELISA 試劑盒說明書測定恒河猴血清MCP-1 和IL-6 細胞因子的水平。

1.3 統計學處理 采用GraphPad Prism 7.0 軟件進行數據分析。本研究數據均為計量資料，采用±s表示，方差齊性檢驗和正態性檢驗后，符合方差齊的多組數據比較采用one-way ANOVA，進一步兩兩比較采用Tukey′s 檢驗；方差不齊多組比較采用Kruskal-Wallis 檢驗，若差異顯著，進一步兩兩比較采用Dunn′s 檢驗；兩樣本比較采用t 檢驗，P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 恒河猴卵巢MCP-1 的表達 與Sham 組相比，OXI 組MCP-1 陽性染色明顯，而FTY-720 組MCP-1陽性染色明顯弱于OXI 組，其與Sham 組染色相似（圖1）。

圖1 MCP-1 在恒河猴卵巢中的表達（免疫組化，200×）Fig 1 Expression of MCP-1 protein in ovary of rhesus monkeys（immunohistochemistry staining，200×）

2.2 恒河猴卵巢CD11b、CD68 的表達 One-way ANOVA 結果顯示，Sham 組、OXI 組和FTY-720 組CD11b 陽性細胞數量[（147.3±73.29）、（469.9±327.5）、（165.1±89.54）cells/mm2]差異顯著（F=4.896，P=0.030 1），進一步兩兩比較結果示，OXI 組高于Sham組和FTY-720 組（均P＜0.05），而FTY-720 組與Sham 組差異不具統計學意義（P＜0.05）。可能由于恒河猴生物個體間差異較大，OXI 組CD68 陽性細胞計數（1 412.0、423.6、393.5 cells/mm2）不符合正態分布，采用Kruskal-Wallis 檢驗，結果顯示，3 組間CD68 陽性細胞數量差異無統計學意義（H=4.419，P=0.113 0），但OXI 組中的3 只恒河猴的卵巢組織CD68 陽性細胞數量均高于Sham 組平均值[（280.1±142.6）cells/mm2]和 FTY -720 組（259.3、328.7、270.8 cells/mm2），而FTY-720 組CD68 陽性細胞數量接近Sham 組水平（圖2）。

圖2 CD11b、CD68 在恒河猴卵巢中的表達及其陽性細胞計數的比較（免疫組化，200×）Fig 2 Expression and positive cells counts of CD11b，CD68 protein in ovary of rhesus macaques（immunohistochemistry staining，200×）

2.3 ELISA 法檢測各組血清MCP-1 和IL-6 水平 照射后3 個月，Sham 組、OXI 組及FTY-720 組恒河猴血清MCP-1 濃度分別為（396±122）、（299±47）和（256±21）pg/mL，差異無統計學意義（F=2.640，P=0.150 5）；照射后9 個月，3 組間血清MCP-1 濃度差異顯著（F=9.328，P=0.014 4）。進一步Tukey′s 檢驗結果顯示，OXI 組血清MCP-1 濃度[（502±105）pg/mL]明顯高于Sham 組[（296±43）pg/mL]，差異具有統計學意義（P=0.031 4）；FTY-720 組血清MCP-1 濃度[（265±56）pg/mL]明顯低于OXI 組（P=0.017 2），其與Sham 組血清MCP-1 濃度差異無統計學意義（P＜0.05）。僅OXI 組血清MCP-1 濃度照射前后差異有統計學意義（t=3.056，P=0.018 9）。IL-6 僅在OXI組中被檢測到，3 個月時為（4±1）pg/mL，9 個月時為（9±6）pg/mL，兩個檢測點的濃度差異無統計學意義（t=1.424，P＜0.05），見圖3。

圖3 恒河猴血清MCP-1 和IL-6 的水平Fig 3 The serum level of MCP-1 and IL-6 in rhesus monkey

3 討論

放射治療是惡性腫瘤的治療主要手段之一，但是放射治療會加速卵泡丟失，從而導致卵巢激素分泌減少，卵泡閉鎖，最終耗竭卵泡儲備池，導致絕經提前及不孕[7]。一項兒童期癌癥幸存者治療后健康風險評估研究表明，盆腹腔放射治療是女性卵巢功能衰竭和過早絕經的重要危險因素之一[8]。同樣，接受放射治療的青少年和年輕成人癌癥幸存者發生POF 的風險也明顯增加[9]，這一性腺毒性作用成為癌癥治療的常見晚期效應，對幸存者的生活質量有著嚴重影響。

放射性損傷研究發現，放射線暴露可激活機體免疫系統，活化的巨噬細胞等免疫細胞釋放大量促炎細胞因子和趨化因子，且該現象會持續存在。Christersdotti 等[5]研究發現，在放射治療結束156 周后，受照射的人動脈組織中趨化因子2（CCL2/MCP-1）和CCL5 的表達量和巨噬細胞（CD68+）數量均明顯高于未受照射的動脈組織，研究人員利用嚙齒動物模型也重現了這一病理現象。最新研究還發現，單次輻射暴露2 個月后，雄性哥廷根小型豬循環系統功能受損，肝臟、腎臟組織出現纖維化等慢性炎性損傷改變[6]，以上研究均提示放射治療誘發的慢性炎癥可對機體產生持續性損傷。而目前大多數研究主要集中于放射治療對卵巢的早期影響，在嚙齒動物模型研究中發現放射治療可導致卵巢急性炎性損傷，且在放射治療前給與白藜蘆醇、N-乙酰半胱氨酸、香芹酚或百里香酚等抗炎抗氧化物質干預后，可抑制放射治療誘發的急性炎癥并減輕卵巢損傷[2-4]，但是可能由于嚙齒動物卵巢和人類卵巢對放射線敏感性不同，在臨床治療過程中，接受放射治療的年輕女性卵巢功能衰竭并非立即發生，而是一個逐漸加速的過程[10]。綜上所述，筆者認為，放射治療誘發的卵巢炎性反應可持續作用于卵巢組織，是卵巢輻射暴露后卵泡持續丟失的主要原因之一。

本研究結果顯示，恒河猴卵巢組織在接受直接照射9 個月后，OXI 組卵巢組織MCP-1 表達強于Sham 組和炎性抑制組（FTY-720 組），提示卵巢組織處于炎性狀態，可能已啟動單核細胞的聚集和浸潤。同時筆者對卵巢組織進行了CD11b、CD68 陽性巨噬細胞計數，OXI 組卵巢組織CD11b、CD68 陽性巨噬細胞數量均高于Sham 組和FTY-720 組，可能由于靈長類動物的個體差異以及樣本量有限的原因，組間差異不具有統計學意義。此外，本研究還對恒河猴機體炎性狀態進行了評估，發現X 射線照射9 個月后，OXI 組恒河猴血清趨化因子MCP-1 及促炎細胞因子IL-6 顯著高于Sham 組，且照射結束后，血清MCP-1 及IL-6 水平呈現逐漸升高趨勢，均提示放射線激活免疫系統后可導致機體處于長期慢性炎癥狀態，而FTY-720 組恒河猴血清MCP-1 及IL-6 水平均與Sham 組相似，證實了放射治療結束后卵泡持續丟失可能與炎癥反應有關。

本研究選擇的炎性指標MCP-1，是單核細胞趨化的關鍵因子，可將循環中的單核細胞趨化募集到組織分化為單核細胞來源的巨噬細胞，并將巨噬細胞活化為可產生促炎細胞因子和趨化因子的M1 型巨噬細胞，進一步促進炎性介質的分泌和釋放，最終影響卵巢細胞增殖、激素分泌和排卵，導致卵巢功能下降或喪失，目前已有多篇文獻報道了其與卵巢功能障礙的相關性[11]。CD68 是成熟巨噬細胞表面標志物，主要表達于卵巢血管結締組織，少量表達于黃體顆粒細胞膜層區域。CD11b 是M1 型巨噬細胞的一種標志物，在炎癥中表達增加，發揮促炎作用[12]，主要在卵巢排卵后的卵泡膜層、間質及黃體中表達[13]。本研究選擇在恒河猴卵巢早卵泡期取材，避免了卵巢生理性原因引起的巨噬細胞數量及表型的改變。IL-6 是細胞因子網絡中的重要成員，在炎癥中處于中心地位，可由單核細胞、中性粒細胞、巨噬細胞等多種細胞產生[14]，具有多種生物學效應，在免疫應答和炎癥中發揮重要作用，其分泌增加可導致卵巢性腺激素分泌紊亂、黃體功能障礙、影響胚胎著床及其發育，已成為POF 相關研究觀察指標之一[15-16]。

綜上所述，X 射線照射卵巢后所引起的持續性炎癥，可能是卵巢功能損傷的又一原因。而X 射線照射前卵巢內注入FTY-720 可保護卵巢功能，其機制可能與抑制卵巢單核細胞募集，減少M1 型巨噬細胞及促炎因子IL-6，趨化因子MCP-1 分泌有關。本研究使用的動物模型為靈長類動物恒河猴，其卵巢結構、卵泡募集、發育機制與人類最為接近，有利于研究成果的臨床轉化。FTY-720 有望成為一種安全、高效的體內卵巢保護劑，可以改善女性腫瘤患者放射治療后的生活質量。但是由于經費和時間的原因，本研究未能在信號通路上深入探討FTY-720卵巢保護的具體機制，以及其對卵母細胞質量的影響，需要后期做進一步的深入研究。

致謝：感謝美國OHSU 大學（Oregon Health&Science University）Mary B.Zelinski 教授對本研究的指導和無私幫助。