基于開放式三明治酶聯(lián)免疫分析的雌二醇檢測方法的建立

王文皓，閆若辰，魏琳納，袁玉華

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300052；2.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院空港醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300308）

雌二醇是一種類固醇激素，其結(jié)構(gòu)為小分子化合物[1]。臨床檢測雌二醇時由于其抗體結(jié)合位點(diǎn)少，多采用適合半抗原的競爭性免疫分析方法[2-3]。競爭性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）由于無法檢測微量的抗原，所以認(rèn)為其敏感性會低于非競爭性免疫分析[4]。

開放式三明治酶聯(lián)免疫分析（open sandwich ELISA，OE-ELISA）最早在1996 年由Ueda 等[5]提出。本實(shí)驗(yàn)通過將抗體重鏈可變區(qū)（heavy chain variable area，VH）片段與堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）連接，抗體輕鏈可變區(qū)（light chain variable area，VL）片段與大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白（maltose binding protein，MBP）和小分子泛素相關(guān)修飾物蛋白（small ubiquitin-related modifier protein，sumo）連接，來建立檢測雌二醇的OE-ELISA 方法。并從檢測敏感性角度對比競爭ELISA 與OE-ELISA。為各種抗原，特別是分子量小于1 000 的小分子物質(zhì)進(jìn)行非競爭性夾心檢測奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 抗雌二醇單克隆抗體T18 株由本實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒載體pET28a（+）購自南京金斯瑞有限公司；大腸桿菌Rosetta（DE3）和BL21（DE3）菌株購自天根生化科技（北京）有限公司；HisTrapTMHP 鎳柱購自GE Healthcare 公司；Estradiol-ALP 試劑由博奧賽斯（天津）生物科技有限公司饋贈；實(shí)驗(yàn)用雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品及其他生化試劑購自索萊寶生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建 通過測序確定單克隆抗體T18株的VH 和VL 基因序列。在pET28a（+）質(zhì)粒載體上分別拼接3 段序列，即：VH 序列與ALP 序列（GenBank：AZR39392.1），VL 序 列 與MBP 序 列（GenBank：AHM36606.1），VL 序 列、MBP 序 列 與sumo 序 列（GenBank：ADF45345.1）。交由南京金斯瑞生物有限公司合成基因并構(gòu)建質(zhì)粒。

1.2.2 ALP-VH 融合蛋白的表達(dá) 將pET28a（+）/ALP-VH 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，平板劃線挑取單克隆菌落接種于LB 培養(yǎng)基中。在37℃下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，加入0.5 mmol/L 異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl B-D-thiogalactoside，IPTG）誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生蛋白。實(shí)驗(yàn)設(shè)置2 種轉(zhuǎn)化宿主菌：BL21（DH3）和Rosetta（DH3）；2 種不同溫度：22℃和37℃來對比ALP-VH 融合蛋白的表達(dá)情況。在4 ℃、12 000 r/min 條件下離心10 min 收集菌體，重懸于1×PBS 中。將收集到的菌液進(jìn)行超聲破碎，取沉淀和上清樣品，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，觀察蛋白產(chǎn)量及可溶性表達(dá)情況。破碎后的菌液經(jīng)離心后取上清，再通過HisTrapTMHP鎳柱純化。最終經(jīng)SDS-PAGE 電泳和Western 印跡驗(yàn)證，測定蛋白濃度后，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 sumo-MBP-VL 融合蛋白的表達(dá) 通過上述方法，初次表達(dá)pET28a（+）/MBP-VL 重組質(zhì)粒時，同樣在2 種轉(zhuǎn)化宿主菌和2 種不同溫度下進(jìn)行誘導(dǎo)，觀察蛋白表達(dá)情況。在pET28a（+）/MBP-VL 質(zhì)粒上添加sumo 序列后，再次表達(dá)，觀察蛋白可溶性表達(dá)情況。收集sumo-MBP-VL 融合蛋白后通過鎳柱純化，經(jīng)SDS-PAGE 電泳和Western 印跡驗(yàn)證后，測定蛋白濃度，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 競爭法檢測雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品 在96 孔微孔板上包被羊抗鼠抗體，4℃過夜孵育。第2 天，用PBST（0.05% Tween-20 的1×PBS）洗液在自動洗板機(jī)上洗滌微孔板。每孔添加純化后的雌二醇抗體T18，37℃孵育1 h，再用5%脫脂奶粉在37℃孵箱中孵育2 h 進(jìn)行封閉。清洗酶標(biāo)板后添加稀釋過的雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品（100、50、10、5、1、0.5、0 ng/mL）和E2-ALP 耦聯(lián)物，37℃反應(yīng)1 h。徹底清洗酶標(biāo)板后加入ALP 底物（PNPP）37℃避光顯色30 min 后，讀取405 nm 處的吸光度值。每個濃度重復(fù)測定5 次后，以雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，B/B0 值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，帶入曲線分析試驗(yàn)敏感性。

1.2.5 OE-ELISA 檢測雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品 在96 孔板上包被sumo-MBP-VL 融合蛋白，4℃過夜孵育。用PBST 洗液清洗后，每個孔中加入5%脫脂奶粉封閉。將雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋到100、50、10、5、1、0.5、0 ng/mL 后，加入到清洗后的微孔板中。在37℃孵育1 h 后再次清洗微孔板。再加入ALP-VH 融合蛋白，37℃孵育1 h 后用PBST 進(jìn)行充分洗滌。最后加入PNPP 顯色，讀取405 nm 處的吸光度值。對每個濃度重復(fù)測定5 次，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算實(shí)驗(yàn)敏感性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS10.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。對計(jì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，其中，±s 表示各濃度重復(fù)測定數(shù)據(jù)的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差；變異系數(shù)（CV）值表述各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異系數(shù)。將兩種方法測得的數(shù)據(jù)分別進(jìn)行回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算相關(guān)系數(shù)r。

2 結(jié)果

2.1 ALP-VH 融合蛋白的表達(dá) 經(jīng)原核系統(tǒng)表達(dá)后，結(jié)果如圖1 所示，在紅色方框內(nèi)已標(biāo)出相應(yīng)目的大小的ALP-VH 融合蛋白。觀察發(fā)現(xiàn)，pET28a（+）/ALP-VH 重組質(zhì)粒成功在大腸桿菌菌株中表達(dá)目的蛋白。通過對比SDS-PAGE 膠上不同誘導(dǎo)條件下蛋白條帶深淺，觀察蛋白在上清液及沉淀物中的相應(yīng)含量，發(fā)現(xiàn)蛋白在不同菌株（BL21、Rosetta）和不同溫度（22℃、37℃）下的蛋白產(chǎn)量無明顯區(qū)別，但均可形成部分可溶性表達(dá)。最終選擇Rosetta 菌株在37℃下誘導(dǎo)的條件進(jìn)行大量表達(dá)。在SDS-PAGE 膠上進(jìn)行大小的確定，結(jié)果見圖2A 中1 號孔內(nèi)紅色方框所示，得到大小約為68 kD 的ALP-VH 融合蛋白。用抗HIS 抗體進(jìn)行Western 印跡檢測，結(jié)果如圖2B 所示，證明純化后得到完整的目的蛋白。

圖1 ALP-VH 融合蛋白表達(dá)Fig 1 Expression of ALP-VH fusion protein

圖2 蛋白純化Fig 2 Protein purification

2.1 sumo-MBP-VL 融合蛋白的表達(dá) pET28a（+）/MBP-VL 重組質(zhì)粒成功在大腸桿菌菌株中表達(dá)目的蛋白。結(jié)果如圖3A 紅色方框內(nèi)所示，觀察蛋白在上清液及沉淀物中的相應(yīng)產(chǎn)量，認(rèn)為MBP-VL 融合蛋白在不同宿主菌（BL21、Rosetta）和不同溫度（22℃、37℃）下均未形成蛋白的可溶性表達(dá)。pET28a（+）/sumo-MBP-VL 重組質(zhì)粒亦在大腸桿菌中成功表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE 膠驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)通過標(biāo)簽的添加使得蛋白在不同宿主菌和溫度下均可形成可溶性表達(dá)，結(jié)果如圖3B 紅色方框內(nèi)所示。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇Rosetta 菌株在37℃下進(jìn)行誘導(dǎo)的條件，制備最大產(chǎn)量的sumo-MBP-VL 融合蛋白。將純化后蛋白經(jīng)SDS-PAGE 膠和Western 印跡驗(yàn)證，結(jié)果見圖2A 中2 號孔內(nèi)紅色方框和圖2B 所示，得到大小約為70 kD的sumo-MBP-VL 融合蛋白。

圖3 MBP-VL 融合蛋白表達(dá)Fig 3 Expression of MBP-VL fusion protein

2.3 競爭法檢測雌二醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 競爭ELISA 測定雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4A 所示。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度較高時，游離的雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品與E2-ALP 在體系內(nèi)競爭抗體結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致與微孔板結(jié)合的E2-ALP 減少，吸光度降低，曲線呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。重復(fù)測定的各濃度標(biāo)準(zhǔn)品的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差及CV 已由表1 列出。通過CV 值可以看出實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。根據(jù)曲線相關(guān)系數(shù)r2為0.961，說明曲線相關(guān)性良好。代入數(shù)據(jù)得到競爭ELISA 最低檢出限為803 pg/mL。

2.4 OE-ELISA 檢測雌二醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 OEELISA 測定雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4B所示。酶標(biāo)板上成功包被了VL 有效片段對雌二醇進(jìn)行吸附，雌二醇再與VH 有效片段結(jié)合，最后經(jīng)ALP和底物反應(yīng)進(jìn)行顯色，完成測定。根據(jù)各孔OD405 值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過曲線可知，標(biāo)準(zhǔn)品與兩種融合蛋白形成了良好的結(jié)合，且反應(yīng)呈線性。根據(jù)表1 列出的各濃度標(biāo)準(zhǔn)品的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)據(jù)可得OE-ELISA 的回歸方程為：y=0.029 6x+1.302 9，r2=0.996 1。各組重復(fù)數(shù)據(jù)通過表1 中CV 值可以看出實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。計(jì)算此方法敏感性，可以達(dá)到532 pg/mL 。

表1 兩種方法檢測雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值（±s）及變異系數(shù)（CV）Tab 1 Absorbance values(±s) and variable coefficient（CV）of estradiol standard samples measured by two methods

表1 兩種方法檢測雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值（±s）及變異系數(shù)（CV）Tab 1 Absorbance values(±s) and variable coefficient（CV）of estradiol standard samples measured by two methods

標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/mL） OE-ELISA CV（%） 競爭ELISA CV（%）100 4.201±0.023 0.55 1.129±0.021 1.86 50 10 2.889±0.024 0.83 1.686±0.021 1.25 1.674±0.017 1.02 2.416±0.021 0.87 5 1.425±0.087 6.11 3.030±0.020 0.66 1 1.304±0.013 1.07 4.071±0.023 0.56 0.5 1.248±0.010 0.80 4.321±0.024 0.56 0 1.108±0.009 0.81 4.282±0.008 0.19

圖4 雌二醇測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 4 Standard curve for the determination of estradiol

3 討論

雌二醇是女性體內(nèi)重要的內(nèi)源性雌激素[6]，臨床經(jīng)常用于輔助評價女性卵巢功能[7]。對于臨床常用的競爭法檢測，其測定雌二醇時，需同時放入標(biāo)記和未標(biāo)記（待測樣本）的抗原來競爭包被抗體，被分析物的濃度與顯色程度成反比[8]（圖5A）。由于其需要包被有限的抗體來確保兩種抗原形成競爭關(guān)系，使得微量的待測抗原無法有效地被檢測到。筆者應(yīng)用OE-ELISA 來改善雌二醇的檢測方法。此方法的原理是利用固定化VL 片段和可被檢測的VH 片段，來對抗原進(jìn)行夾心測定。與雙抗體夾心檢測方法不同，此方法只需要一種抗體，規(guī)避了半抗原難以制備多個單克隆抗體的問題[9]。OE-ELISA 自提出后，已被用于瘦肉精等多種物質(zhì)的檢測[10-11]。本實(shí)驗(yàn)將VH 片段與ALP 連接，VL 片段與MBP 和sumo 標(biāo)簽連接，來建立檢測雌二醇的OE-ELISA 方法（圖5B）。

圖5 雌二醇免疫分析檢測原理Fig 5 Principle of estradiol immunoassay

在與抗體片段融合的蛋白的選擇上，由于ALP與常用的辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）相比，得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果更穩(wěn)定和準(zhǔn)確[12]，所以選擇其作為VH 片段的連接物。ALP-VH 融合蛋白可以直接被檢測，縮短了檢測所用的時間。并且VH與ALP 的融合表達(dá)，不僅節(jié)約時間和成本，而且避免了抗體片段在標(biāo)記過程中失活[13-15]。為了滿足VL片段的順利表達(dá)，筆者選擇MBP 和sumo 蛋白作為其融合伙伴。其中MBP 在實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)可以提高蛋白的產(chǎn)量[16-18]，sumo 標(biāo)簽被證實(shí)可以促進(jìn)蛋白的可溶性表達(dá)[19-20]。在本實(shí)驗(yàn)中，通過添加sumo 標(biāo)簽，改善了Lim 等[21]建立OE-ELISA 時所用的MBP-VL 融合蛋白，實(shí)現(xiàn)了包被片段的可溶性表達(dá)。添加的MBP和sumo 蛋白在本實(shí)驗(yàn)中也起到與酶標(biāo)板結(jié)合的作用，使得VL 片段的抗原結(jié)合位點(diǎn)充分暴露，便于其后續(xù)與抗原更有效地結(jié)合。

在原核表達(dá)的宿主菌和溫度的選擇上，Rosetta菌株被證實(shí)適宜應(yīng)用在具有T7 啟動子和稀有密碼子的融合基因序列的表達(dá)中[22]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在Rosetta菌株中37℃下進(jìn)行誘導(dǎo)得到的sumo-MBP-VL 融合蛋白的產(chǎn)量最佳。

本實(shí)驗(yàn)基于sumo-MBP-VL 和ALP-VH 融合蛋白成功建立了OE-ELISA 方法。在測定雌二醇時，該方法比競爭ELISA 在分析敏感性上提高了約1.5 倍。OE-ELISA 方法的建立不僅為雌二醇檢測方法的研究奠定了基礎(chǔ)，也為其他半抗原的檢測提供了新的思路。