澤瀉對MSG大鼠IL-6、TNF-α含量和基因表達的影響

黃春麗 馮光維 余躍生 鄧 瑩

黔南民族醫學高等專科學校，貴州 都勻 558013

澤瀉為澤瀉科植物澤瀉Alismaorientale(Sam)Juzep 的干燥塊莖，始載于《神農本草經》，列為上品，性寒，味甘，味淡，歸膀胱經、腎經，具有利水滲濕瀉熱、化濁降脂的功效，臨床常用于治療小便不利、水腫漲滿、痰飲眩暈、熱淋澀痛等病癥[1]。現代研究[2-3]發現，澤瀉中含有多種化學成分，主要以三萜類和倍半萜類為主，有利尿、降血脂、降血糖、抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用。目前對澤瀉的研究更多集中在利尿及調血脂方向，近年來也有學者[4-5]研究了對澤瀉的抗炎及免疫調節作用，但針對澤瀉干預糖尿病相關炎癥的研究較少，為此本實驗擬通過高糖高脂飲食配合腹腔注射谷氨酸鈉復制MSG 肥胖大鼠模型，給予澤瀉醇提物治療后，觀察MSG肥胖大鼠血清及肝臟中炎癥相關因子表達，為澤瀉治療糖尿病提供更多理論依據。

1 材料與儀器

1.1 動物 SD孕鼠，體重(300～400 g)，由長沙市天勤生物技術有限公司提供，動物合格證編號：SCXK(湘 )2014—0011。實驗前 1周飼養于黔南民族醫學高等專科學校實驗動物中心，自由飲食，溫度 18～22 ℃。

1.2 藥品 澤瀉(黔南州鼎鑫生物科技有限公司，批號：180431)；非諾貝特(江蘇瑞年前進制藥有限公司，批號：1803241)；羅格列酮(成都瑞恒有限公司，批號：190512)。

1.3 試劑與儀器 白介素-6(IL-6)試劑盒(批號：L141118510)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒(批號：L141118514)，均由Uscn Life science Inc公司提供。Trizol試劑(Servicebio公司，批號：G3013)；HyPure TMMolecular Biology Grade Water(HyClone公司，批號：SH30538.02)；Servicebio?RT First Strand cDNA Synthesis Kit(Servicebio公司，批號：G3330)；2×SYBR Green qPCR Master Mix(High ROX)(Servicebio公司，批號：G3322)；引物合成(上海生工生物工程股份有限公司合成)；D3024R臺式高速冷凍型微量離心機(DragonLab公司)；PC-1000 PCR逆轉錄儀(PERKIN ELMER公司)；CFX96型Real-Time PCR儀(Bio-Red公司)；SW-CJ-1FD超凈工作臺(蘇凈安泰公司)；Epoch酶標檢測儀(BioTeK公司)。見表1。

表1 PCR引物序列

2 方法

2.1 澤瀉醇提物的制備 先將澤瀉藥材粉粹成粗粉，取粗粉1 kg加80%乙醇回流提取3次，每次2 h，減壓回收溶劑得澤瀉醇提取物。

2.2 模型建立及分組 SD大鼠新生乳鼠從第2天開始皮下注射L-谷氨酸鈉，劑量為4 g·kg-1·d-1連續注射7 d，正常對照組給予等量生理鹽水。MSG組給予高脂飼料喂養，正常對照組普通飼料，8周后眼眶采血檢測空腹血糖及血脂變化，以空腹血糖及血脂水平顯著高于正常組為造模成功標準。將符合模型標準的48只大鼠，按隨機數字表法分為6組，分別為模型組、羅格列酮5 mg/kg組、非洛貝特100 mg/kg組、澤瀉4 g生藥/kg組、澤瀉2 g生藥/kg組及澤瀉1 g生藥/kg組，另取8只空白大鼠作為正常對照組。各組每日灌胃相應藥物，連續 8周，給藥期間自由進食，飲水。

2.3 標本采集 給藥8周后，末次給藥前禁食12 h，給藥1 h后，3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈采血，3500 r·min-1，離心15 min，分離血清，分裝凍存備用；迅速摘除肝臟、脾臟與胰腺組織剝離周圍脂肪組織，稱重后液氮凍存。

2.4 指標檢測

2.4.1 臟器系數的計算 將剖取的脾臟、胰腺組織，用生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分后，稱重，計算臟器系數。臟器系數=臟器重量(mg)/大鼠體重(g)×100%

2.4.2 血清中IL-6、TNF-α含量檢測 采用免疫熒光法檢測血清中IL-2，TNF-α含量，具體步驟嚴格按照試劑盒要求進行。

2.4.3 肝臟組織IL-6 mRNA，TNF-α mRNA的檢測 取肝臟研磨后，加入TRIzol按說明提取RNA，按照試劑盒說明書進行反轉錄，進行PR-PCR實驗。

3 結果

3.1 澤瀉對MSG大鼠脾臟及胰腺系數的影響 給藥8周后，與正常對照組相比，模型對照組脾臟系數顯著降低(P<0.01)，胰腺系數顯著升高(P<0.01)；與模型對照組相比，羅格利酮組胰腺系數顯著降低(P<0.01)，非諾貝特組脾臟系數顯著升高(P<0.01)；澤瀉高、中劑量組脾臟系數顯著升高(P<0.01，P<0.05)，澤瀉高、中劑量組胰腺系數顯著降低(P<0.01，P<0.05)。澤瀉低劑量組對脾臟及胰腺系數沒有明顯影響。見表2。

表2 澤瀉對MSG大鼠脾臟及胰腺系數的影響

3.2 澤瀉對MSG大鼠血清中IL-6、TNF-α含量的影響 給藥8周后，與正常對照組相比，模型對照組血清IL-6和TNF-α含量顯著升高(P<0.01)；與模型對照組相比，羅格利酮、非諾貝特組血清IL-6和TNF-α含量顯著降低(P<0.01，P<0.05)；澤瀉高、中劑量組肝臟血清IL-6和TNF-α含量顯著降低(P<0.01，P<0.05)。澤瀉低劑量組對血清IL-6和TNF-α含量沒有明顯影響。見表3。

表3 澤瀉對MSG大鼠血清IL-6和TNF-α含量的影響

3.3 澤瀉對MSG大鼠肝臟中IL-6 mRNA，TNF-α mRNA表達的影響 給藥8周后，與正常對照組相比，模型對照組肝臟IL-6 mRNA和TNF-αmRNA相對含量顯著升高(P<0.01)；與模型對照組相比，羅格利酮、非諾貝特組肝臟IL-6 mRNA和TNF-αmRNA相對含量顯著降低(P<0.01，P<0.05)；澤瀉高、中劑量組肝臟IL-6 mRNA和TNF-αmRNA相對含量顯著降低(P<0.01，P<0.05)；澤瀉低劑量組肝臟IL-6 mRNA和TNF-αmRNA相對含量沒有明顯變化。見表4。

表4 澤瀉對MSG大鼠肝臟IL-6 mRNA和TNF-αmRNA表達的影響

4 討論

2型糖尿病是一種受環境和遺傳因素影響的慢性代謝性疾病，前期患者出現高血糖、高血脂等癥狀，近年來大量的實驗及臨床研究[6]發現炎癥因子紊亂也是糖尿病特征之一，因此抑制2型糖尿病患者前期體內炎癥反應有重要的臨床意義。IL-6是一種由脂肪分泌的具有免疫活性的細胞，不僅參與能量代謝與機體炎性反應也密切相關[7]，作為研究糖尿病最突出的炎癥因子之一，研究[8]表明IL-6能使胰島β細胞受損進而引起胰島素抵抗，最終使血糖水平升高，故IL-6的水平可作為判斷糖尿病的重要指標。TNF-α也是一種由脂肪分泌的促炎因子，TNF-α能作用于脂肪及周圍組引起胰島素抵抗，還可以刺激其他炎癥因子如IL-6的分泌加重胰島素抵抗。本實驗結果顯示采用MSG加高脂飼料復制的MSG肥胖大鼠血清及肝臟中IL-6和TNF-α含量及基因表達都顯著升高，經過澤瀉醇提物干預后各組大鼠血清中IL-6和TNF-α含量下降，肝臟中IL-6和TNF-αmRNA相對表達下降，說明澤瀉具有一定抗炎作用，其作用機制與抑制炎癥相關因子IL-6和TNF-α的含量及基因表達密切相關。