參柏濕疹搽劑質量控制方法研究

曾 金 李 萍 歐人豪 肖 萍

廣西壯族自治區柳州市婦幼保健院，廣西科技大學附屬婦產醫院 兒童醫院，廣西 柳州 545001

參柏濕疹搽劑由柳州市婦幼保健院皮膚科用于治療皮膚濕疹的經驗方開發而成。由七味中藥組成，包括苦參、黃柏、地榆、紫草、馬齒莧、雷公藤、丹參等，具有清熱燥濕止癢，涼血活血透疹的功效,臨床用于兒童皮膚濕疹具有較好的療效。方中苦參、黃柏清熱燥濕,為主藥，苦參中的主要有效成分苦參堿和氧化苦參堿，黃柏中主要有效成分小檗堿、黃柏堿，具有抗菌、抗炎、抗病毒和免疫調節等作用[1-3]。研究通過對黃柏和苦參進行薄層鑒別，同時采用高效液相色譜法對苦參中主要有效成分苦參堿、氧化苦參堿，黃柏中主要有效成分小檗堿和黃柏堿進行含量測定，來達到保證制劑質量和療效的目的。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀(島津香港有限公司)；FA1004電子分析天秤(上海天平儀器廠)；HH-6數顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇市環宇科學儀器廠)；KQ-300DB數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；ZF-1三用紫外分析儀(上海精科實業有限公司)；DHG-9023AD電熱恒溫鼓風干燥箱(上海東麓儀器設備有限公司)。

1.2 材料 硅膠板(批號：20181212，青島海洋化工有限公司)；硅膠預制板G(批號：20130107，國藥集團化學試劑有限公司)。苦參對照藥材(批號：121019-200705，中國藥品生物制品檢定所)、黃柏對照藥材(批號：121510-201606，中國食品藥品檢定研究院)；黃柏堿對照品(批號：yz180414)、小檗堿對照品(批號：yz180103)、苦參堿對照品(批號：yz170331)、氧化苦參堿對照品(批號：yz170614)均為南京源植生物科技有限公司；參柏濕疹搽劑(每瓶500 mL)由柳州市婦幼保健院藥劑科制劑室提供；乙腈(天津市科密歐化學試劑有限公司) 、甲醇(天津市四友精細化學品有限公司)為色譜純；其他試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 苦參薄層鑒別 取本品20 mL，加濃氨試液調pH=9，用三氯甲烷萃取3次(分別為20、15、10 mL)，合并三氯甲烷層，水浴蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。另取缺苦參的陰性樣品，同法制備得苦參陰性對照品溶液。取苦參對照藥材2 g，加水200 mL煎煮，濾過，濾液濃縮至20 mL，按樣品處理方法制備藥材供試品。精密稱取苦參堿對照品適量，加甲醇制成0.18 mg·mL-1的對照品溶液。

照薄層色譜法(《中國藥典》2015年版一部附錄VIB)試驗，吸取以上溶液各10 uL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮-乙酸乙酯-濃氨(2∶3∶4∶0.15)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液，日光下檢視[1-6]。結果樣品與對照品和對照藥材在相同位置有橙色斑點，陰性對照無干擾。如圖1所示。

注：1.陰性對照；2.對照藥材；3.苦參堿對照品；4～6.為供試品

2.1.2 黃柏薄層鑒別 取本品50 mL，加熱濃縮至20 mL，加甲醇20 mL，超聲處理20 min，過濾，濾液蒸干，甲醇2 mL溶解，離心2 min，取上清液作為供試品溶液。另取缺黃柏的陰性樣品，同法制備得黃柏陰性對照溶液。精密稱取黃柏對照藥材0.1 g，置于錐形瓶中，加甲醇20 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液濃縮至2 mL，得黃柏對照藥材溶液。精密稱取適量黃柏堿、鹽酸小檗堿標準品，加甲醇溶解，制成含量分別為0.24 mg·mL-1、0.23 mg·mL-1的黃柏堿對照品溶液和鹽酸小檗堿對照品溶液。

按薄層色譜法(《中國藥典》2015年版一部附錄VIB)試驗，吸取以上溶液各10 uL分別點于同一硅膠G板上，以正丁醇-冰醋酸-水(7∶2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干。噴以稀碘化鉍鉀試液，日光下檢視。結果樣品與對照藥材和對照品在相同位置有橘色斑點，陰性對照無干擾。如圖2所示。

注：1.陰性對照；2、3、4.供試品；5.對照藥材；6.黃柏堿對照品；7.小檗堿對照品

2.2 苦參堿和氧化苦參堿含量測定

2.2.1 溶液的制備

2.2.1.1 供試品溶液 精密量取濕疹方樣品 5 mL，置于分液漏斗中，加入濃氨試液1 mL，充分振搖后，用30 mL氯仿分3次萃取，每次10 mL，收集氯仿層，置于蒸發皿中，水浴蒸干，殘渣用0.1%磷酸水溶液溶解定容至25 mL，微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.2.1.2 陰性對照 按參柏濕疹搽劑處方工藝制備缺苦參的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成缺苦參的陰性對照溶液。

2.2.1.3 混合對照品溶液 精密稱取苦參堿對照品和氧化苦參堿適量，用0.1%磷酸水超聲溶解，定容，得到70.4 μg·mL-1苦參堿，19.2 μg·mL-1氧化苦參堿混合對照溶液[7-9]。

2.2.2 色譜條件 Diamonsil C18(2)(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流動相為乙腈-甲醇-0.1%磷酸=3∶4∶93，流速1.0 mL/min，柱溫30°C，波長220 nm，進樣量20 μL。

2.2.3 專屬性試驗 分別取混合對照品溶液，供試品溶液和陰性對照溶液20 μL按照上述色譜條件進行測定，記錄色譜圖(如圖3所示)。結果表明，供試品溶液中苦參堿和氧化苦參堿色譜峰于相鄰色譜峰有效分離，分離度均大于1.5，陰性對照表明無其他雜質干擾。

圖3 苦參堿和氧化苦參堿高效液相色譜圖

2.2.4 線性關系 精密稱取苦參堿對照品 4.4 mg，氧化苦參堿對照品1.2 mg，加適量0.1%磷酸溶液超聲溶解，定容至25 mL。分別取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL, 用0.1%磷酸溶液定容至5 mL，得到苦參堿17.6、35.2、70.4、105.6、140.8、176 μg·mL-1和氧化苦參堿4.8、9.6、19.2、28.8、38.4、48 μg·mL-1的混合對照溶液。以0.45 μm的微孔濾膜過濾后按2.2.2色譜條件進樣，記錄峰面積，以峰面積為Y軸，對照品濃度為X軸，繪制標準曲線，進行線性回歸，得到苦參堿回歸方程為Y=11608X+38703(R2=0.9995),氧化苦參堿回歸方程為Y=12758X+22513(R2=0.9999)，結果表明，苦參堿在17.6～176 μg·mL-1質量濃度范圍內，氧化苦參堿在4.8～48 μg·mL-1質量濃度范圍內與峰面積成良好的線性關系。

2.2.5 精密度 精密吸取制備好的同一供試品溶液20 μL，按“2.2.2”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果顯示，苦參堿、氧化苦參堿峰面積的RSD分別為0.943%、0.465%(n=6)，表明該色譜條件下方法精密度良好。

2.2.6 穩定性 精密吸取制備好的同一供試品溶液20 μL，按“2.2.2”項下色譜條件，分別在制備樣品后 0、2、4、6、8、10、24 h 進樣，記錄峰面積。結果顯示，苦參堿、氧化苦參堿峰面積的RSD分別為1.23%、1.52%(n=6)，均<3%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.2.7 重復性 取同一批次參柏濕疹搽劑，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，平行6份，按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，苦參堿、氧化苦參堿的平均含量分別為226.19、33.78 μg·mL-1，RSD 分別為 1.41%、1.75%(n=6)，均<3%，表明該方法重復性較好。

2.2.8 加樣回收率 取已知含量的參柏濕疹搽劑1.25 mL，混合對照1.25 mL(其中苦參堿：樣品含量=1∶1，氧化苦參堿：樣品含量=1∶1)，再按“2.2.1(1)”項下方法制備供試品溶液，平行制備6份，按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算回收率。結果顯示，苦參堿和氧化苦參堿的平均加樣回收率分別為 104.49%、96.30%，RSD 分別為2.76%、2.05%(n=6)，表明該方法準確度較好。結果見表1。

表1 苦參堿和氧化苦參堿加樣回收測定結果 (n=6)

2.2.9 樣品含量測定 取3個批次(批號20200423，20200522，20200624)參柏濕疹搽劑樣品各3瓶(每瓶500 mL)，按照“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品中苦參堿和氧化苦參堿的含量求平均值。結果顯示，3個批次樣品中苦參堿、氧化苦參堿的平均含量分別為208.44 μg·mL-1、41.04 μg·mL-1，平均總含量為249.48 μg·mL-1。按平均含量的80%設限，初步擬定每瓶制劑中苦參堿、氧化苦參堿總含量不得少于199.6 μg·mL-1。樣品中苦參堿、氧化苦參堿含量測定結果見表2。

表2 三批樣品中苦參堿和氧化苦參堿含量測定結果 (n=3)

2.3 黃柏堿和小檗堿含量測定

2.3.1 溶液的制備

2.3.1.1 供試品溶液 取樣品2.5 mL，加1%鹽酸甲醇定容至5 mL，離心，取上清液微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.3.1.2 陰性對照 按參柏濕疹搽劑處方工藝制備缺黃柏的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成缺黃柏的陰性對照溶液。

2.3.1.3 混合對照品溶液 精密稱取黃柏堿對照品和小檗堿適量，用50%(1%鹽酸)甲醇水溶解，定容，得到15 μg·mL-1黃柏堿，65 μg.mL-1小檗堿混合對照溶液[10-13]。

2.3.2 色譜條件 Diamonsil C18(2)(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流動相為乙腈(A)-0.2%磷酸(每100 mL含十二烷基磺酸鈉0.1 g)(B)，梯度洗脫(見表3)，流速1.0 mL·min-1，柱溫30°C，波長284 nm，進樣量20 μL。

表3 梯度洗脫程序

2.3.3 專屬性試驗 分別取混合對照品溶液，供試品溶液和陰性對照溶液20 μL按照上述色譜條件進行測定，記錄色譜圖(如圖4所示)。結果表明，供試品溶液中黃柏堿和小檗堿色譜峰與相鄰色譜峰有效分離，分離度均大于1.5，陰性對照表明無其他雜質干擾。

圖4 黃柏堿和小檗堿高效液相色譜圖

2.3.4 線性關系考察 精密稱取黃柏堿對照品2.4 mg，50%(1%鹽酸)甲醇水定容至10 mL，得0.24 mg·mL-1黃柏堿溶液。精密量取2.5 mL黃柏堿溶液置于10 mL容量瓶中，再加入精密稱定的小檗堿對照品2.6 mg，用50%(1%鹽酸)甲醇水定容至刻度，搖勻。分別取0.4、0.8、1.25、2.1、2.5 mL，用50%(1%鹽酸)甲醇水溶液定容至5 mL，得到黃柏堿4.8、9.6、15、20.4、25.2、30 μg.mL-1和小檗堿20.8、41.6、65、109.2、130 μg·mL-1的混合對照溶液。以0.45 μm的微孔濾膜過濾后按2.3.2色譜條件進樣，記錄峰面積，以峰面積為Y軸，對照品濃度為X軸，繪制標準曲線，進行線性回歸，得到黃柏堿回歸方程為Y=28545X+12888(R2=0.9999)，小檗堿回歸方程為Y=51.187X+98.34(R2=0.9995)，結果表明，黃柏堿在4.8～30 μg·mL-1質量濃度范圍內，小檗堿在20.8～130 μg·mL-1質量濃度范圍內與峰面積成良好的線性關系。

2.3.5 精密度 精密吸取制備好的同一供試品溶液20 μL，按“2.3.2”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果顯示，黃柏堿、小檗堿峰面積的RSD分別為0.874%、1.643%(n=6)，表明該色譜條件下方法精密度良好。

2.3.6 穩定性 精密吸取制備好的同一供試品溶液20 μL，按“2.3.2”項下色譜條件，分別在制備樣品后 0、2、4、6、8、10、24 h 進樣，記錄峰面積。結果顯示，黃柏堿、小檗堿峰面積的RSD分別為1.15%、1.90%(n=6)，均<3%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.3.7 重復性 取同一批次參柏濕疹搽劑，按2.3.1項下方法制備供試品溶液，平行6份，按2.3.2項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，黃柏堿、小檗堿的平均含量分別為24.5、84.5 μg·mL-1，RSD 分別為 1.46%、2.16%(n=6)，均<3%，表明該方法具有良好的重復性。

2.3.8 加樣回收率 取已知含量的參柏濕疹搽劑1.25 mL，混合對照1.25 mL(其中黃柏堿：樣品含量=1∶1，小檗堿：樣品含量=1∶1)，再按“2.2.2.1(1)”項下方法制備供試品溶液，平行制備6份，按“2.3.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算回收率。結果顯示，黃柏堿和小檗堿的平均加樣回收率分別為 96.03%、99.87%，RSD 分別為2.35%、1.79%(n=6)，表明該方法準確度較好。結果見表4。

表4 黃柏堿和小檗堿加樣回收測定結果 (n=6)

2.3.9 樣品含量測定 取3個批次(批號20200423，20200522，20200624)參柏濕疹搽劑樣品各3瓶(每瓶500 mL)，按照2.3.1項下方法制備供試品溶液，按2.3.2項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品中黃柏堿和小檗堿的含量求平均值。結果顯示，3個批次樣品中黃柏堿、小檗堿的平均含量分別為25.39 μg·mL-1、 84.99 μg·mL-1。按平均含量的80%設限，初步擬定每瓶制劑中黃柏堿含量不得少于20.3 μg·mL-1、小檗堿含量不得少于68.0 μg·mL-1。樣品中黃柏堿、小檗堿含量測定結果見表5。

表5 三批樣品中黃柏堿和小檗堿含量測定結果 (n=3)

3 討論

苦參和黃柏是參柏濕疹搽劑方中的君藥，所以選擇對苦參和黃柏進行定性鑒別和定量檢測，以苦參中主要有效成分苦參堿、氧化苦參堿，黃柏中的主要有效成分小檗堿和黃柏堿為檢測指標建立了高效液相色譜含量測定方法。考慮中藥復方制劑中苦參堿和氧化苦參堿可能在一定條件下相互轉化[14]，選擇苦參堿和氧化苦參堿的總量為檢測指標。

在進行黃柏的薄層鑒別時，樣品中的黃柏堿斑點看不到，加大點樣量以后看到了，可知是樣品中黃柏堿含量較低的緣故。調整樣品處理量為50 mL后，可以看到黃柏堿斑點。

進行小檗堿含量測定研究時，發現測得的含量不穩定，考慮其溶解性的緣故，經過嘗試甲醇，1%鹽酸甲醇，50%甲醇水后，調整樣品和對照品的配制溶劑為50%(1%鹽酸甲醇)水。經過調整后，峰型較好，含量比較穩定。

綜上，研究建立了參柏濕疹搽劑中苦參、黃柏的薄層色譜鑒別方法，鑒別斑點清晰，陰性對照無干擾；建立了搽劑中苦參堿、氧化苦參堿和黃柏堿、小檗堿的高效液相色譜含量測定方法，并初步擬定了苦參堿和氧化苦參堿總含量不少于199.6 μg·mL-1，黃柏堿、小檗堿含量分別不少于20.3 μg·mL-1和68.0 μg·mL-1的質量標準。