火療彝方搽劑的質量標準研究

蘇學燕 張英秀 沙學忠 阿俄拉子 張志鋒，3*

1.西南民族大學藥學院，四川 成都 610225；2.四川省涼山彝族自治州中西醫結合醫院，四川 西昌 615000；3. 四川省羌彝藥用資源保護與利用技術工程實驗室，四川 成都 610225

彝藥是中國民族醫藥的重要組成部分，具有上千年臨床實踐的特點[1]。火療彝方搽劑收集彝族畢摩經書中記載的藥物和彝族常用有效藥物組成，是涼山州中西醫結合醫院彝醫醫院使用多年的臨床經驗方，包括曲洛(五加皮)、曲土(沒藥)、瓦布友(兩頭毛)、斯赤尼(接骨木)、爾勒斯此(防風)、楚補(木瓜)、布扎(桑百皮)等藥材。其中五加皮、沒藥、防風、木瓜、桑白皮、收載于2020版《中國藥典》，兩頭毛、接骨木收載于2005版《云南省中藥材標準》。該搽劑有活血化瘀，止痛的作用，主治風濕病，痛風等。歷代醫家認為防風有解表散風、祛風止痙等功效，可治療外感風寒、周身盡痛、風寒濕痹、骨節疼痛等癥，尤其是其具有治療風濕的確切療效，被大眾普遍認可，也是一種具有較大開發價值的中藥材資源。而防風中色原酮類化合物是其發揮藥效的重要有效成分，升麻素苷是防風色原酮的主要成分[2-5]，因此本實驗對該搽劑防風中升麻素苷進行了測定。目前該搽劑沒有相關的質量研究，對該產品的使用和推廣有一定的制約，因此本實驗對火療彝方搽劑藥材五加皮、防風、木瓜、桑白皮、接骨木進行了薄層色譜鑒別，同時對含有的主要指標成分之一升麻素苷作了定性、定量的實驗探討，建立的定性、定量方法簡便精確，能有效控制該制劑的內在質量。

1 儀器與材料

1.1 儀器 WatersUPLCCLASS超高效液相色譜儀(Empower3色譜工作站)；ACQUITYUPLCHSSC18色譜柱(2.1 mm×100 mm Column，1.8μm，Waters公司)；METTLERTOLEPOME55電子天平[梅特斯-托利多儀器(上海)有限公司]；KQ-300DE型數控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；HWS-12型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司)。

1.2 材料 防風對照藥材(批號：20092301)、五加皮對照藥材(批號：20052204)、木瓜對照藥材(批號：20092301)、桑白皮對照藥材(批號：20061302)、升麻素苷對照品(批號：20061302，HPLC>98%)、熊果酸對照品(批號：20080412，HPLC>98%)、5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品(批號：20030104，HPLC>98%)、異嗪嚏定對照品(批號：19111305，HPLC>98%)均購自成都康邦生物科技有限公司。接骨木對照藥材(批號：200219-054，北京康農興牧科技發展中心)；屈臣氏水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)；色譜級甲醇、乙腈(北京迪科馬科技有限公司)；色譜級磷酸(天津市科密歐化學試劑有限公司)；分析純鹽酸(天津市科密歐化學試劑有限公司)；薄層色譜硅膠G板(批號：20170902，青島海洋化工廠)，薄層色譜硅膠GF254板(批號：20190916，青島海洋化工廠)。

2 方法與結果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITYUPLCHSSC18色譜柱(2.1 mm×100 mm Column，1.8 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)梯度洗脫(0～5 min，15%A；5～12 min，15%～19%A；12～12.5 min，19%～25%A)；檢測波長：254 nm；流速：0.2 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：1 μL。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取火療彝方搽劑處方藥材共14.4 g，加入55%的乙醇100 mL，浸泡15 d,用干燥濾器濾過，搖勻，作為供試品溶液。

2.1.3 對照品溶液的制備 精確稱取升麻素苷對照品7.02 mg，用甲醇溶解，制得0.702 mg/mL的標準溶液,作為對照品溶液。

2.1.4 陰性對照溶液的制備 按處方制備不含防風藥材的陰性樣品溶液，照“2.1.2”制備成陰性對照樣品溶液。

2.1.5 色譜條件與系統的適應性試驗 按2.1.1項下條件，取上述升麻素苷溶液、火療彝方搽劑溶液、陰性對照樣品溶液各1 μL，進行測定，同時記錄色譜結果。結果顯示，火療彝方搽劑溶液和升麻素苷溶液的保留時間和峰型一致，陰性對照樣品溶液色譜圖中無干擾峰出現。如圖1所示。

A.對照品；B.供試品；C.陰性對照

2.1.6 線性關系考察 分別精密吸取1 mL質量濃度為0.702 mg/mL的對照品貯備液，置5 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，依次逐級取1 mL定容為0.7020、0.1404、0.0280、0.0056、0.0011 mg/mL的質量濃度，經微孔濾膜濾過，按2.1.1項下條件進樣測定，記錄峰面積。橫坐標為升麻素苷進樣濃度(C)、縱坐標為色譜峰峰面積值(Y)，并繪制標準曲線，得到y=12376023x+24720(R2=0.9999)的回歸方程。結果顯示，升麻素苷在0.0011～0.7020 mg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

2.1.7 精密度試驗 精密吸取2.1.3項下對照品溶液適量，按2.1.1項下條件連續重復進樣6次，并記錄峰面積。結果升麻素苷峰面積的RSD為0.19%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.1.8 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，分別于0,1,2,4,8,12,24 h時進樣測定，記錄峰面積。結果升麻素苷峰面積的RSD為0.27%(n=6)，表明供試品溶液在24h內穩定。

2.1.9 重復性試驗 精密吸取樣品適量，按照火療彝方搽劑制備方法平行制備6份供試品溶液，按2.1.1項下條件進樣測定。結果升麻素苷峰含量的RSD為1.49%(n=6)，表明方法重復性良好。

2.1.10 加樣回收試驗 精密吸取6份已知含量的樣品適量，分別精密加入對照品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算加樣回收率。結果見表1。

表1 火療彝方搽劑加樣回收率試驗測定結果 (n=6)

2.1.11 樣品含量測定 取6批樣品，依法制備供試品溶液，按2.1.1項下條件進樣測定，記錄峰面積，并計算升麻素苷含量。結果如表2。

表2 火療彝方搽劑升麻素苷含量測定試驗結果 (n=6)

2.2 薄層色譜鑒別

2.2.1 溶液的制備 取火療彝方搽劑20 mL，蒸干，殘渣加2 mL甲醇，溶解，作為供試品溶液。另取防風、五加皮、木瓜、桑白皮、接骨木對照藥材各1g,分別加入55%乙醇溶液10 mL，浸泡15 d，過濾，蒸干，殘渣加2 mL甲醇，作為防風、五加皮、木瓜、桑白皮、接骨木的對照藥材溶液。

按照處方組成量，分別去除防風、五加皮、木瓜、桑白皮，精密稱取其余藥味，浸泡15 d，過濾，蒸干，殘渣加甲醇2 mL，分別作為防風、五加皮、木瓜、桑白皮陰性對照溶液；按照處方組成量，去除接骨木、桑白皮、兩頭毛、防風、精密稱取其余藥味，浸泡15 d，過濾，蒸干，殘渣加甲醇2 mL，作為接骨木陰性對照溶液；

分別稱取升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、異嗪嚏定、熊果酸對照品，加10 mL甲醇,分別制成每1 mL含有1 mg的升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、異嗪嚏定、熊果酸的對照品溶液。

2.2.2 試驗方法 薄層色譜法按《中國藥典》(2020年版)四部通則0502，點樣量約10 μL。薄層板：防風，木瓜，桑白皮為硅膠G薄層板 ；五加皮，接骨木為硅膠GF254薄層板。展開劑為防風：三氯甲烷-甲醇(7∶1)；五加皮：三氯甲烷-甲醇(21∶1)；木瓜：環己烷-乙酸乙酯-丙酮-甲酸(6∶0.5∶1∶0.1)；桑白皮：三氯甲烷-甲醇(9∶1)；接骨木：三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(24∶4∶1)。均在紫外光燈(365 nm)下檢視。

2.2.3 結果 供試品色譜中，在與防風、五加皮、木瓜、桑白皮、接骨木對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；在與升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、異嗪嚏定、熊果酸對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；陰性對照無干擾。結果如圖2、圖3、圖4、圖5、圖6所示。

1-3.供試品；4.防風對照藥材；5.升麻素苷對照品；6.5-O-甲基維斯阿米醇苷對照；7.陰性對照品

1.供試品；2.五加皮對照藥材；3.異嗪嚏定對照品；4.陰性對照

1.供試品；2.木瓜對照藥材；3.熊果酸對照品；4.陰性對照

1-3.供試品；4.桑白皮對照藥材；5.陰性對照品

1-3.供試品；4.接骨木對照藥材；5.陰性對照

3 討論

實驗分別考察了超聲、加熱回流2種提取方法，結果無差異，因此選擇操作簡便的超聲提取法；考察甲醇、乙醇和50%甲醇3種不同提取溶劑[6]及30、45、50、55、60 min 4種不同提取時間，結果甲醇超聲45 min時升麻素苷提取率較高，故以甲醇超聲45 min為最終提取條件。

采用PDA檢測器對升麻素苷成分進行全波長掃描，結果發現于254 nm波長處升麻素苷成分的干擾較小，峰形對稱，分離效果好，故選擇254 nm作為升麻素苷含量測定的最佳波長。流動相最初選擇采用甲醇-水溶液[7]，但其基線不穩，后采用乙腈-0.1%磷酸溶液以(15∶85)，其基線較平穩，信號干擾小，但峰分離效果差，因此采用乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)梯度洗脫(0～5 min，15%A；5～12 min，15%～19%A；12～12.5 min，19%～25%A)，各色譜峰較好的分離，峰形也對稱。因此選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動相。

本研究建立的TLC法專屬性強，無干擾；UPLC法測定升麻素苷成分的含量，具有分析速度快、準確性高、重復性好的優點，可用于火療彝方搽劑中主要防風藥材的質量控制，同時為提高火療彝方搽劑的質量標準提供參考。

火療技術是收集彝族民間特色技術改進而成，具有良好的溫通經脈，散寒除濕作用[8]。其能夠利用酒精燃燒時的熱力，使藥效透過皮膚，刺激體表穴位和病位，通過經絡傳導，激活臟腑經絡功能，調整機體陰陽氣血運行(調氣)[9-10]。痛風是一種臨床上以關節炎和高尿酸血癥反復發作為特征的疾病。據相關研究[11-12]痛風的發病率很高。火療彝方搽劑加工工藝簡單使用方便，未發現毒副作用，在涼山州中西醫結合醫院彝醫醫院治療痛風的臨床應用超過5年，病例數超5000例，總有效率達91.02%。彝醫藥是中醫學的重要組成部分,而彝藥劑型集中體現了彝醫幾千年來臨床用藥的特點[13-14]。本研究對火療彝方搽劑中的主要成分之一升麻素苷進行了定性定量的檢測，同時對主藥刺五加、防風、木瓜、桑白皮、接骨木進行了薄層鑒別。綜上所述，本研究為火療彝方搽劑質量標準的研究奠定了基礎。

隨著中藥現代化的發展,彝藥作為中醫藥學的重要分支，缺乏科學的研究，而彝藥制劑更是面臨著前所未有的機遇和挑戰。采用現代分析方法從工藝、標準、化學成分等方面去分析彝藥制劑，不僅能促進彝藥制劑的進一步開發利用，也能為研發歷史悠久的彝藥制劑提供科學的參考方法。讓彝藥制劑在最大限度上造福人類。