佛甲草的質量標準研究

黃 瑋 李翔宇 趙彩云

1.江蘇省徐州市食品藥品監督檢驗中心，江蘇 徐州 221006；2.徐州醫科大學，江蘇 徐州 221000

佛甲草為景天科植物佛甲草SedumlineaeThunb.的干燥全草 。主要分布于中南及江蘇、浙江、安徽、福建、江西、四川、貴州、云南、陜西、甘肅、臺灣等地[1]。有清熱解毒、消腫止血等功效。用于咽喉腫痛、目赤、痢疾、丹毒、帶狀皰疹、癰腫、燙、火傷和外傷出血[2]。現收載于《江蘇省中藥飲片炮制規范》2002年版，原標準只有性狀鑒別，目前尚無有關佛甲草質量控制方面的文獻報道，為了更好地控制該飲片的質量和安全性，結合參考文獻[3-5]，本研究通過增加顯微鑒別、薄層鑒別、常規檢查、浸出物測定及以槲皮素、山奈素和異鼠李素作為指標成分進行含量測定，以期建立完善的質量標準，以便控制佛甲草飲片的質量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 FW177高速萬能粉碎機(北京市永光明醫療儀器有限公司)；LEICA DM 2500透射光顯微成像系統(德國萊卡公司)；XSR205電子天平(瑞士Metter公司，精度十萬分之一)；101A-1E型電熱鼓風干燥箱(上海實驗儀器廠有限公司)；SX2-5-12型箱式電阻爐(天津市華北實驗儀器有限公司)；HH-6數顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)；Waters e2695高效液相色譜儀(包括Empower3工作站，四元梯度泵，2998PDA檢測器，自動進樣器和柱溫箱)，均購自于美國Waters公司。

1.2 樣品與試藥 槲皮素對照品(批號：100081-200907,純度為97.4%)，山奈素對照品(批號：110861-201611，純度為95.5%)，異鼠李素對照品(批號：110860-201611，純度為99.8%)，均購于中國食品藥品檢定研究院；佛甲草對照藥材(自制)；甲醇為色譜純(Fish公司)，水為超純水，其他試劑均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)。7批佛甲草飲片由企業提供，經徐州市食品藥品監督檢驗中心趙彩云主任中藥師鑒定為佛甲草SedumlineaeThunb.的干燥全草。詳細信息見表1。

表1 樣品來源信息

2 方法與結果

2.1 顯微鑒別 本品粉末棕色。取本品粉末加水合氯醛試液加熱透化裝片，置顯微鏡下觀察：葉上表皮細胞壁較平直，下表皮細胞壁常波狀彎曲，氣孔不定式。非腺毛單細胞，直徑約20 μm。花粉粒近球形，表面可見顆粒狀紋飾。纖維狹長而筆直，大多成束。草酸鈣簇晶30～75 μm。導管多為螺紋導管 。如圖1所示。

1. 葉上表皮細胞；2.葉下表皮細胞(氣孔)；3.非腺毛；4.花粉粒；5.纖維；6.簇晶；7.導管

2.2 薄層鑒別 取供試品粉末1 g,加甲醇20 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 mL溶解，作為供試品溶液。另取佛甲草對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2015年版四部通則0502)[6]57試驗，吸取上述兩種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-三氯甲烷(1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%磷鉬酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。如圖2所示。

1.對照藥材； 2～8.供試品

2.3 水分、總灰分、酸不溶性灰分測定 取佛甲草飲片粉末(過二號篩)2 g，精密稱定，分別照《中國藥典》2015年版四部通則0832項下水分測定法(第二法 烘干法)、通則2302項下總灰分和酸不溶性灰分測定法測定水分[6]103、總灰分和酸不溶性灰分[6]204。各批次飲片均平行操作3次，取平均值。結果顯示，7批佛甲草的水分含量為8.04%～9.73%，平均值為9.07%，以平均值的120%設限，為10.88%，故暫定本品水分不得過11.0%。總灰分含量為15.07%～20.53%，平均值為17.87%，以平均值的120%設限，為21.44%，數值較高故暫定不收入正文。酸不溶性灰分含量為5.12%～8.99%，平均值為7.14%，以平均值的120%設限，為8.56%,故暫定本品酸不溶性灰分不得過9.0%。詳見表2。

2.4 浸出物測定 取佛甲草飲片粉末(過二號篩)2 g，精密稱定，照《中國藥典》2015年版四部通則2201水溶性浸出物測定法項下的熱浸法測定浸出物含量[6]202。 以干燥品計算供試品中水溶性浸出物的含量(%)，結果7批佛甲草飲片水溶性浸出物含量為25.42%～40.12%，平均值為30.30%，以平均值的80%設限，為24.24%，故暫定本品水溶性浸出物不得少于24.0%。詳見表2。

表2 樣品水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物測定結果 (RSD<2.0%，n=3)

2.5 含量測定

2.5.1 色譜條件與系統適應性試驗 色譜柱：C18(ZORBAX,XDB,250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：甲醇-0.4%磷酸溶液(45∶55)，流速：1.0 mL/min,柱溫：32 ℃，檢測波長：360 nm，進樣量10 μL。槲皮素、山柰素和異鼠李素峰與各自相鄰峰的分離度均大于2.0，理論板數均大于5000。

2.5.2 對照品溶液 取槲皮素、山柰素和異鼠李素對照品適量，精密稱定，分別100 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制備各單一對照品母液。分別精密量取一定量的各對照品母液，置同一50 mL量瓶中，用甲醇稀釋制成每1毫升含槲皮素40.87 μg、山柰素5.75 μg和異鼠李素5.92 μg的混合對照溶液。

2.5.3 供試品溶液 取本品2.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-30%鹽酸溶液(4∶1)25 mL，稱定重量，置水浴中加熱回流 30 min，迅速冷卻至室溫，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.5.4 陰性樣品溶液 取制備供試品溶液的溶劑，按照供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。

2.5.5 系統適應性試驗 分別吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μL，按“2.5.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，結果顯示，供試品色譜中槲皮素、山柰素和異鼠李素與各自相鄰峰的分離度均大于2.0，理論板數均大于5000，陰性樣品無干擾。色譜圖如圖3所示。

A. 對照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性對照溶液；1.槲皮素； 2.山柰素；3.異鼠李素

2.5.6 定量限與檢測限考察 分別精密量取“2.5.2”項下對照品溶液適量，以甲醇倍比稀釋，并按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，以信噪比為10∶1和3∶1分別計算3種待測成分的定量限和檢測限。結果顯示槲皮素、山奈素和異鼠李素的定量限分別為0.0163 μg/mL、0.0230 μg/mL、0.0237 μg/mL,檢測限分別為0.006 μg/mL、0.0078 μg/mL、0.0079 μg/mL。

2.5.7 線性關系考察 分別精密量取“2.5.2”項下對照品溶液2、5、10、15、20、25 μL, 按“2.5.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標，進樣量(X, μg)為橫坐標進行直線回歸，得回歸方程：Y(槲皮素)=4.0684×106X-2.1006×103(r=0.9999,n=6);Y(山奈素)=4.6136×106X+7.6703×103(r=0.9993,n=6)；Y(異鼠李素)=4.3187×106X+6.9922×103(r=0.9990,n=6)，槲皮素進樣量在0.08173～1.2260 μg，山柰素進樣量在0.01151～0.1726 μg，異鼠李素進樣量在0.01184～0.1776 μg的范圍內線性關系良好。

2.5.8 精密度考察 取“2.5.2”項下對照品溶液，按“2.5.1”項下色譜條連續進樣6次，測定面積，結果槲皮素平均峰面積為1655646，RSD為0.28%(n=6)，山奈素峰平均峰面積為266269，RSD為1.01%(n=6)，異鼠李素平均峰面積為259635，RSD為1.68 %(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.5.9穩定性試驗 取同一批供試品溶液(批號：20151210)，按“2.5.1”項下色譜條件進行測定，分別在0，2，4，8，12，24 h進樣，測定峰面積，結果槲皮素平均峰面積為1664001，RSD為0.41%(n=6)，山柰素平均峰面積為114870，RSD為1.67%(n=6)，異鼠李素平均峰面積為261482，RSD為1.61%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.5.10 重現性試驗 取同一批號(批號：20151210)樣品6份，按“2.5.3”項下供試品溶液制備方法制備供試液，再按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定,結果槲皮素、山柰素和異鼠李素的平均含量分別為0.4057 mg/g、0.0229 mg/g和0.0577 mg/g，RSD分別為1.77%、1.97%和1.86%(n=6)，表明方法的重現性良好。

2.5.11 加樣回收試驗 精密量取已知含量的樣品(批號：20151210，槲皮素的平均含量為0.4053 mg/g，山柰素的平均含量為0.0230 mg/g, 異鼠李素的平均含量為0.0583 mg/g)約1.25 g，共6份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入槲皮素對照品溶液(0.1022 mg/mL)5 mL、山柰素對照品溶液(0.01471 mg/mL)2mL和異鼠李素對照品溶液(0.02396 mg/mL)3 mL，按“2.5.3” 項下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，再按“2.5.1”項下色譜條件進行測定，分別測定峰面積并計算加樣回收率。結果見表3。

表3 加樣回收率試驗結果 (n=6)

2.5.12 樣品測定 分別取各批次飲片細粉適量，按“2.5.3”項下供試品溶液制備方法制備供試液，再按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定,記錄色譜圖，并根據標準曲線計算3種成分含量，結果按干燥品計算。見表4。

表4 樣品含量測定結果表

3 討論

在薄層色譜鑒別研究中考察了甲苯-三氯甲烷(1∶1)、環己烷-乙酸乙酯(40∶1)為展開劑進行薄層層析，結果甲苯-三氯甲烷(1∶1)為展開劑，層析的結果較好，斑點清晰；不同薄層板(Merck硅膠G板、青島海洋硅膠G 板、自制硅膠G層板)進行比較，結果不同薄層板,薄層色譜分離效果均好，斑點清晰；不同溫、濕度條件(t：5 ℃，RH：30%；t：18 ℃，RH：40%；t：23 ℃，RH：50%))及穩定性(0、2、8、24 h)試驗，結果在三種溫濕度條件下薄層色譜結果均穩定，斑點清晰，供試品溶液經放置24 h后，層析結果依然穩定，斑點清晰。結果表明該方法可行。

浸出物含量測定中，分別采用不同浸出方法(熱浸法、冷浸法)，不同溶劑(乙醇、稀乙醇、 70%乙醇、30%乙醇、水)進行了比較，結果表明，采用熱浸法，以水為溶劑，測得浸出物量最高。故選擇水為溶劑，熱浸法進行浸出物測定。

含量測定中，流動相的選擇根據有關參考文獻[7]報道槲皮素、山柰素與異鼠李素的HPLC測定方法，流動相為甲醇-0.4%磷酸溶液(50∶50)進行試驗，發現供試品溶液中異鼠李素峰與前后峰沒完全分開，故提高流動相中水相的比例，結果各峰分離度較好，所以最終確定流動相為甲醇-0.4%磷酸溶液(45∶55)。供試品制備方法的選擇，對供試品回流溫度、時間及加入鹽酸濃度等影響因素進行了考察，結果加入甲醇-30%鹽酸(4∶1)25 mL沸水浴回流30 min可酸解完全，樣品重復性高。本研究建立的含量測定方法能同時測定佛甲草中槲皮素、山柰素和異鼠李素的含量，其中槲皮素含量最高，占測定的3種成分總含量的70%左右。據文獻[8]報道，槲皮素具有抗氧化、抗病毒和抗炎的作用，與佛甲草具有清熱解毒、消腫止血等功效一致。因此，選擇槲皮素作為該飲片含量限定的指標成分，7批樣品槲皮素的平均含量為0.031%, 以平均值的80%設限，為0.025%， 故暫定本品含槲皮素不得低于0.025%。