聚乙二醇修飾的四氧化三錳納米粒子對軟骨細胞炎癥模型的影響*

張盛清，蔡金宏，黃蘭麗，高 明△，趙勁民,4,5△

（1.廣西組織器官修復醫用生物材料工程技術研究中心；2.廣西醫科大學再生醫學與醫用生物資源開發應用協同創新中心；3.廣西醫科大學藥學院；4.廣西再生醫學重點實驗室；5.廣西醫科大學第一附屬醫院創傷骨科手外科，南寧 530021）

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種以疼痛、軟骨缺損和關節炎癥為特征的慢性疾病，目前臨床上的治療方式十分有限[1]。目前有一種觀點認為，活性氧（reactive oxygen species，ROS）作為一種參與細胞內信號傳導的重要物質[2-4]，在調節軟骨細胞衰老、凋亡、細胞外基質合成和降解的同時，也在骨關節炎的進展中產生了重要的影響[5]。當ROS濃度超過了機體的抗氧化能力時，將產生大量的氧化中間產物，進而導致軟骨細胞DNA 損傷，干擾和抑制軟骨基質合成并激活基質金屬蛋白酶，造成軟骨細胞死亡加快OA 的進程。所以，清除致損氧化中間產物，減緩氧化應激效應，被認為是治療OA的可行方案。四氧化三錳納米粒子（Mn3O4NPs）是目前倍受眾關注的一種納米酶材料，由于有著Mn2+/Mn3+的混合氧化狀態、高不可逆氧化穩定性、大比表面積等特點，使Mn3O4NPs具有了顯著的多重擬酶活性[6-7]。本研究將通過表面修飾加強Mn3O4NPs的生物相容性，并探討修飾后的Mn3O4NPs 通過清除ROS 對OA的抗炎抗氧化作用。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 動物 SD 大鼠（SPF 級），體重（180±2）g，廣西醫科大學實驗動物中心提供，本實驗已通過實驗動物倫理審批，審批編號No.202010023。

1.1.2 試劑 四水合醋酸錳[Mn(CH3COO)2·4H2O]（aladdin，上海）；水合肼（N2H4）（aladdin，上海）；無水乙醇（sinopharm，上海）；無水甲醇（sinopharm，上海）；聚乙二醇（PEG Mn=3 350）（sigma-aldrich，美國）；過氧化氫（H2O2）（JINSHAN，成都）；CCK-8 檢測試劑盒（sigma-aldrich，美國）；鈣黃綠素（Calcein-AM）（sigma-aldrich，美國）；碘化丙啶（PI）（sigma-aldrich，美國）；超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（sigma-aldrich，美國）；過氧化氫酶（CAT）檢測試劑盒（beyotime，上海）；羥自由基（·OH）檢測試劑盒（solarbio，北京）；組織細胞RNA 小量提取試劑盒（magen，廣州）；胎牛血清（every green，浙江）；高糖培養基（gibco，美國）。

1.1.3 儀器與設備 透射電子顯微鏡（TEM）（HITACHI，日本）、X射線衍射儀（XRD）（Rigaku，日本）；傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR）（SHIMADZU，日本）；納米粒度及ZETA 電位分析儀（Malvern，英國）；全波長酶標儀（Thermo Fisher Scientific，美國）；PCR 儀（Roche，瑞士）；熒光成像顯微鏡（OLYMPUS，日本）；超純水機（Merck，德國）；5810R 低溫高速離心機（Eppendorf，德國）；電熱真空干燥箱（博訊實業，上海）。

1.2 材料合成

1.2.1 Mn3O4NPs的合成

在已有文獻[8]的技術上進行改進，在室溫條件下合成了Mn3O4NPs。首先稱取400 mgMn(CH3COO)2·4H2O置于圓底燒瓶內，加入60 mL 超純水充分溶解并保持攪拌。向攪拌的液體中快速加入1 mL N2H4，保持攪拌。反應24 h后將溶液轉移至潔凈的50 mL離心管內，離心10 min 去除上清液，用無水甲醇重復洗滌沉淀3次，重懸沉淀后再次離心，去除上清液后得到深褐色沉淀，將深褐色沉淀65°C真空干燥12 h。干燥所得褐色固體即為Mn3O4NPs。

1.2.2 聚乙二醇修飾的四氧化三錳納米粒子（Mn3O4-PEG NPs）的合成 稱取MPEG=5%MMn的PEG，充分溶解于無水乙醇中并加入充分分散的Mn3O4NPs，保持攪拌。反應24 h 后將溶液轉移至潔凈的50 mL 離心管內，高速離心10 min 去除上清液，用無水甲醇重復洗滌沉淀3次，重懸沉淀后再次離心，去除上清液后得到深褐色沉淀，將沉淀65°C真空干燥12 h。干燥所得褐色固體即為Mn3O4-PEG NPs。

1.3 材料表征

將上述真空干燥所得材料，取少量粉末分別用于TEM、XRD、FTIR和ZETA電位測量。

1.4 Mn3O4-PEG NPs 的擬SOD 酶活性、擬CAT 酶活性和羥自由基（·OH）清除率測量

根據試劑盒說明書，計算好樣品分組及試劑用量，分別配制適量的工作液和樣本溶液。對于擬SOD酶活性測量，根據超氧陰離子氧化WST-8顯色的原理，通過計算不同樣品450 nm 處的吸光值，即可得知不同樣本中的超氧陰離子（·O2-）清除率；對于擬CAT酶活性測量，根據H2O2氧化顯色底物顯色的原理，通過計算不同樣品520 nm 處的吸光值，即可得知不同樣本中的H2O2清除率；對于·OH清除率測量，根據·OH 可與顯色劑反應顯色的原理，通過計算不同樣品536 nm處的吸光值，即可得知不同樣本中的·OH清除率。

1.5 軟骨細胞的原代培養

軟骨組織取自3～5 日齡SD 乳鼠的關節部分，并用含10%青鏈霉素雙抗的PBS 沖去凝血和雜質。組織塊置于潔凈的培養皿中，先用胰酶在37°C下消化2 h，之后離心去除上清液收集沉淀，收集到的沉淀用Ⅱ型膠原酶重懸，并在37°C 培養箱中消化過夜。次日，差速離心去除消化剝離的纖維后，離心收集游離出的軟骨細胞。將已收集好的軟骨細胞重懸后接種于培養皿中，待細胞貼壁后傳代培養，傳至P2～P3代使用。

1.6 生物相容性檢測

CCK-8法：將約8×103個/孔P2～P3代軟骨細胞接種于96 孔板內，培養細胞24 h 后，分別更換用無血清培養基配制的不同濃度的材料溶液。繼續培養細胞24 h后先吸去孔內液體，并用生理鹽水沖洗兩邊去除殘余材料。隨后加入按1∶10 比例配制好的CCK-8 工作液110 μL，繼續孵育1 h。因CCK-8工作液會與孔內活細胞產生橙黃色甲臜物，測量各孔內液體在450 nm 處的吸光值即可得知各實驗組細胞存活量。

細胞活死染色法：將約2×105個/孔P2～P3代軟骨細胞接種于放置有爬片的6 孔板內，培養細胞24 h 后，分別更換用無血清培養基配制的不同濃度的材料溶液。繼續培養細胞24 h 后，先吸去孔內液體，并用生理鹽水沖洗兩邊去除殘余材料。用配制好的Calcein-AM/PI染色工作液浸沒過爬片，避光染色10 min，隨后用生理鹽水沖洗3 次去多余染料。完成爬片染色后，將爬片置于熒光成像顯微鏡下，隨機選取3個視野觀察和拍照記錄。

1.7 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測

將約3×105個/孔P2～P3代軟細胞接種于6孔板內。當細胞完全貼壁后，吸除孔內液體，并用生理鹽水沖洗兩邊除去雜質和未貼壁細胞。隨后加入用無血清培養基配制的濃度為200 μmol/L 的H2O2誘導細胞進入氧化應激狀態。待誘導細胞完成后，再加更換有不同材料的無血清培養基，繼續培養細胞 24 h。次日吸除孔內液體，并用生理鹽水沖洗兩邊去除殘余的材料，隨后按照試劑盒說明書提取各實驗組mRNA 樣本，保存于-80°C 冰箱中，以備用于RT-qPCR實驗。RT-qPCR所用引物序列，見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.8 統計學方法

采用SPSS 26.0統計軟件對相關實驗數據進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間均數對比采用t檢驗；多組間均數對比采用One-way anova，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TEM檢查結果

TEM 顯示，合成的Mn3O4-PEG NPs 呈方臺狀，粒子分散性良好，見圖1。

圖1 Mn3O4-PEG NPs透射電鏡圖

2.2 XRD表征結果

XRD 圖譜顯示，所合成的Mn3O4NPs 主峰未出現較大偏移，在2θ=18.2°、26.3°、29.0°、31.1°、32.5°、36.2°、38.2°、44.6°、50.8°和60.0°處分別出現了與標準Mn3O4卡片（JCPDS24-0734）對應的強衍射峰，由此可認為Mn3O4NPs已成功合成。PEG修飾后所得的Mn3O4-PEG NPs 也含有相同的衍射峰，峰強比和半峰寬沒有出現明顯改變，說明修飾過程對Mn3O4NPs 的微觀結構沒有造成明顯影響，基本保持了Mn3O4NPs原本的結晶度，見圖2A。

2.3 FTIR表征結果

FTIR 結果顯示，相比于修飾前，修飾后的Mn3O4-PEG NPs 含有與對照PEG 樣品相同的紅外吸收峰峰，證明PEG已成功修飾到Mn3O4NPs表面，見圖2B。

圖2 XRD和FTIR表征結果

2.4 Mn3O4 NPs 和Mn3O4-PEG NPs 的ZETA 電位測量結果

修飾后Mn3O4NPs 表面的ZETA 電位發生了明顯的改變，由-18.27 mV轉變為-8.74 mV，這是由于PEG 的鏈狀分子包覆于Mn3O4NPs 外表，屏蔽了粒子部分表面電荷所致，證明PEG 成功修飾到了Mn3O4NPs的表面，見圖3。

圖3 Mn3O4 NPs和Mn3O4-PEG NPs的ZETA電位測量結果

2.5 Mn3O4-PEG NPs的生物相容性評價

2.5.1 不同濃度Mn3O4NPs組和Mn3O4-PEG NPs組干預24 h 對軟骨細胞活性的影響 當Mn3O4-PEG NPs濃度約在20 μg/mL以內時，實驗組軟骨細胞活性與空白對照組比較，可以保持在80%以上，對比未經修飾的Mn3O4NPs，在濃度約10 μg/mL 時就已經產生一定毒性，經過修飾的Mn3O4-PEG NPs明顯有著更好的生物相容性，見圖4。

圖4 不同濃度Mn3O4 NPs組和Mn3O4-PEG NPs組干預24 h對軟骨細胞活性的影響

2.5.2 Mn3O4NPs 組和Mn3O4-PEG NPs 組的Calcien-AM/PI 染色和熒光定量分析 當共培養濃度為20 μg/mL時，Mn3O4-PEG NPs對軟骨細胞基本沒有表現出毒性作用，與Mn3O4NPs組比較差異有統計學意義（P＜0.01），見圖5。

圖5 Mn3O4 NPs組與Mn3O4-PEG NPs組的Calcien-AM/PI染色和熒光定量分析

2.6 Mn3O4-PEG NPs的ROS清除作用

伴隨著濃度的升高，Mn3O4-PEG NPs 的擬SOD酶活性也逐漸升高，且與Mn3O4NPs的擬SOD酶活性無顯著區別，見圖6A。在清除H2O2和·OH 兩種活性氧基團時也表現出了較強的活性，且與Mn3O4NPs的清除能力比較差異有統計學意義，見圖6B。證明PEG 修飾在提高Mn3O4-PEG NPs 分散性和生物相容性的同時，未顯著影響Mn3O4NPs的擬酶活性。

圖6 Mn3O4 NPs與Mn3O4-PEG NPs的·O2-、H2O2、·OH清除率對比

2.7 Mn3O4-PEG NPs 對H2O2誘導的軟骨細胞模型中TNF-α、IL-1β和IL-6表達的影響

按最大生物相容劑量，Mn3O4-PEG NPs對TNFα、IL-1β和IL-6 3種炎癥因子的表達均下調，且結果與H2O2組比較差異具有統計學意義（P＜0.01），見圖7。

圖7 Mn3O4-PEG NPs對H2O2誘導的軟骨細胞模型中TNF-α、IL-1β、IL-6表達的影響

3 討論

目前，國內有著大量的患者長期遭受著OA 的折磨[9]，患者在遭受著強烈疼痛的同時，也面臨著極高的致殘風險，這無疑會對患者及其家庭造成沉重的打擊。目前關于OA 的發病機制尚無統一的結論，多數研究認為OA 的發病可能由多種因素綜合引發（如年齡、勞損、內分泌等）。近些年也有研究指出，諸如·O2-、H2O2和·OH等氧化中間產物會導致細胞損傷，引起的細胞內氧化和抗氧化統失衡，是誘發OA 的重要原因之一。因此，控制組織內ROS含量，維持細胞內氧化/抗氧化平衡是治療OA 的一個重要潛在途徑。

盡管生物體內已在自然進化中形成了高效的天然活性氧清除酶，但因其是有機質且對反應環境具有高敏感性（如溫度和pH 穩定性），條件不當時極易失活，難以大量生產、保存和利用。不同于天然酶，人工納米酶有著更好的穩定性，易生產性，且兼具多功能性和可調諧活性，因而目前受到人們廣泛的關注，目前的研究報道中已經發現了不少性能優異的抗ROS納米酶[10-11]。而另一方面，Mn超氧化物歧化酶（SOD）的模擬作用也在藥代動力學研究中被發現，據報道其催化性能是優于Cu/Zn SOD和Fe SOD 的[12]。因此，由于Mn3O4NPs 有著顯著的多重擬酶活性，是目前納米酶研究的熱點之一。在本研究中，所合成的Mn3O4-PEG NPs 電鏡下呈現為大小均勻的方臺狀顆粒，粒徑約為100 nm，分散性良好。XRD、FTIR 和ZETA 電位結果表明，粒子表面成功的修飾有PEG分子，且當濃度在20 μg/mL濃度以下時，Mn3O4-PEG NPs 沒有表現出明顯細胞毒性。綜上所述，Mn3O4-PEG NPs 被成功合成且具有較好的生物相容性。

OA 造成的損傷以軟骨缺損為主，包括·O2-、H2O2和·OH 等氧化中間產物在內的ROS 基團與骨關節疾病的進展呈顯著相關[5]。本研究進一步驗證了Mn3O4-PEG NPs對ROS的催化清除能力，結果顯示，Mn3O4-PEG NPs 在清除·O2-、H2O2和·OH 3 種活性氧基團時均表現出了較高活性，且與Mn3O4NPs的·O2-、H2O2和·OH清除能力相比無統計學差異，證明修飾過程在提高Mn3O4-PEG NPs 分散性和生物相容性的同時，未影響Mn3O4-PEG NPs 發揮其擬酶活性。結果表明，Mn3O4-PEG NPs 具有作為關節腔內清除ROS的納米酶的潛力。

由于ROS是調控炎癥的重要信號分子，ROS的失衡是引起關節炎癥因子表達上調，造成關節軟骨損傷的重要原因之一。而早先的研究中盡管存在一些分歧，但TNF-α、IL-1β 普遍被認為是與關節炎早期發病及關節炎早、晚期病程密切相關的[13]。在本研究中，濃度為20 μg/mL的Mn3O4-PEG NPs成功下調了TNF-α、IL-1β 和IL-6 3 種炎癥因子的表達，且結果具有統計學差異，證明適量的Mn3O4-PEG NPs具有作為關節腔內抗炎藥物的潛力。

綜上所述，本研究成功制備了一種具有良好分散性和多重擬酶活性的抗ROS納米酶，在體外實驗中能有效清除·O2-、H2O2和·OH 3種活性氧基團，且細胞實驗證明，所合成的納米酶生物相容性良好，能夠下調氧化應激狀態下的軟骨細胞中炎癥因子的表達。在未來的實驗中，我們將在保證安全性的前提下，進一步驗證Mn3O4-PEG NPs 在動物體內能否達到治療關節炎的效果，以便對Mn3O4-PEG NPs作為納米酶的功效進行更全面的評價，為其清除ROS 維持組織氧化/抗氧化平衡治療OA 提供更詳實的理論和實驗數據支持。