山枝子莖葉提取物對小鼠急性肝損傷的保護作用研究*

韋莎莎，戴國滿，張曉萍，黃仁彬△

（1.廣西壯族自治區婦幼保健院，南寧 530003；2.廣西壯族自治區人民醫院，南寧 530021；3.廣西醫科大學藥學院，南寧 530021）

山枝子莖和葉（SZZJY）為茜草科植物梔子Gardenia Jasminoides Ellis的莖和葉，常生于低山溫暖的疏林或荒坡中，主要分布于長江以南地區。研究發現，梔子果實主要含有環烯醚萜類、二萜類及有機酸酯類等成分[1-3]，具有保肝、利膽、抗炎、鎮痛及抗氧化等活性[4-6]，梔子葉化學成分中也發現含有梔子苷、京尼平苷等環烯醚萜類[7]。本課題前期研究表明，山枝子根水提物對大鼠肝纖維化有保護作用[8]。本研究旨在對SZZJY水提物進行臨床前藥效學研究，探究其對四氯化碳（CCl4）和D-氨基半乳糖（D-Gal）所致急性化學性肝損傷小鼠的保護作用及其可能機制，為山枝子非傳統藥用部位得到充分利用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級昆明種小鼠60 只，雄性，體重18～22 g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK（桂）2014-0002，動物使用許可證號：SYXK（桂）2014-0003。

1.2 藥物 SZZJY采摘于廣西靈山縣，經過廣西中醫藥研究所賴茂祥教授鑒定。將SZZJY曬干后，依次加入12 倍、10 倍、8 倍量蒸餾水煎煮3 次，收集合并3次提取液，過濾后用減壓濃縮至0.125 g藥液約含1 g生藥。

1.3 主要試劑 CCl4，成都市科龍化工試劑廠，批號：2014 061301；D-Gal，Scientific Research Special，批號：G0500；聯苯雙酯滴丸，北京協和藥廠，批號：15 050207；谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（TBIL）、丙二醛（MDA）、還原型谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、蛋白定量試劑盒（BCA）均購于南京建成生物工程研究所；增殖細胞核抗原（PCNA）、BOSTTER（批號：BM0104）、Bax（批號：NBP2-29468）、Bcl-2（批號：bs-0032R）均購于北京博奧森生物有限公司。

1.4 動物分組及肝損傷模型的建立 所有小鼠適應性喂養3 d后，隨機分為6組，即正常對照組、CCl4/D-Gal 模型組、聯苯雙酯組（150 mg/kg）及SZZJYE高、中、低劑量組（5.00 g/kg、2.50 g/kg、1.25 g/kg），每組10 只。SZZJYE 各劑量組和聯苯雙酯組按0.2 mL/10 g 體重灌胃給予相應藥物，1 次/d，連續7 d。正常對照組和模型組灌胃給予等量生理鹽水。末次給藥1 h后，除正常對照組外，其他各組均注射含0.18% CCl4的花生油溶液[9]或D-Gal 溶液（700 mg/kg）[10]，復制兩種小鼠急性肝損傷模型。正常對照組腹腔注射花生油或生理鹽水。禁食不禁水20 h后取血和臟器進行測定。

1.5 血清生化指標的測定 各組小鼠采用眼球取血，4 ℃下3 000 r/min 離心10 min，取上層血清。按照試劑盒說明書步驟采用酶標法測定小鼠血清ALT、AST 和ALP 含量，全自動生化分析儀檢測血清TBIL含量。

1.6 肝組織生化指標的測定 取肝大葉相同部位的小塊肝組織，用4 ℃生理鹽水漂洗去積血，濾紙拭干后稱重，加適量4 ℃生理鹽水配制10%的肝勻漿，4 ℃下3 500 r/min 離心20 min 后，取上清液。按照試劑盒說明書步驟分別測定肝組織中MDA、GSH含量和GSH-Px、SOD活性。

1.7 臟器指數的計算 眼球取血后處死小鼠，稱重，迅速取出肝臟及脾臟，計算臟器系數：肝臟指數=肝臟重量（g）/體重（g）×100%，脾臟指數=脾臟重量（mg）/體重（g）×100%。

1.8 病理組織學檢查[11]取一小塊浸泡于10%甲醛溶液的肝左葉組織，常規脫水后，石蠟包埋，切片，行蘇木精—伊紅（HE）染色，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察肝組織的病理損傷情況。

1.9 免疫組化法檢測肝組織PCNA、Bax、Bcl-2 蛋白表達 取適量肝臟組織，制備石蠟切片，放在60 ℃烤箱中烘烤1 h，切片室溫冷卻后置于4 ℃冰箱保存，按照免疫組化檢測試劑盒說明書測定肝組織PCNA、Bax、Bcl-2蛋白表達。細胞質或胞核含棕黃色顆粒者為陽性細胞。采用Image-Pro Plus 軟件分析，計算累計光密度值（IOD）。

1.10 統計學方法 用SPSS 22.0 統計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血清ALT、AST、AL含量比較 與正常對照組比較，CCl4及D-Gal模型組血清ALT、AST、ALP活性和TBIL 含量升高（P＜0.01）；與相應模型組比較，SZZJYE 各劑量組ALT、AST、ALP 活性和TBIL含量降低（P＜0.05），見表1、表2。

表1 SZZJYE對CCl4所致急性肝損傷小鼠血清ALT、AST、ALP及TBIL含量的影響 ±s，n=10

表1 SZZJYE對CCl4所致急性肝損傷小鼠血清ALT、AST、ALP及TBIL含量的影響 ±s，n=10

與正常對照組比較，△P＜0.01；與CCl4模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

表2 SZZJYE對D-Gal所致急性肝損傷小鼠血清ALT、AST、ALP及TBIL含量的影響 ±s，n=10

表2 SZZJYE對D-Gal所致急性肝損傷小鼠血清ALT、AST、ALP及TBIL含量的影響 ±s，n=10

與正常對照組比較，△P＜0.01；與D-Gal模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.2 各組肝組織氧化應激相關指標含量的比較

與正常對照組比較，CCl4及D-Gal 模型組肝組織MDA 含量升高，GSH 含量及SOD、GSH-Px 活性降低（P＜0.05）；與相應模型組比較，SZZJYE各劑量組MDA 含量降低，GSH 含量及SOD 和GSH-Px 活性升高（P＜0.05），見表3、表4。

表3 SZZJYE對CCl4所致急性肝損傷小鼠肝組織SOD、MDA、GSH、GSH-Px水平的影響 ±s，n=10

表3 SZZJYE對CCl4所致急性肝損傷小鼠肝組織SOD、MDA、GSH、GSH-Px水平的影響 ±s，n=10

與正常對照組比較，△△P＜0.05，△P＜0.01；與CCl4模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

表4 SZZJYE對D-Gal所致急性肝損傷小鼠肝組織SOD、MDA、GSH、GSH-Px水平的影響 ±s，n=10

表4 SZZJYE對D-Gal所致急性肝損傷小鼠肝組織SOD、MDA、GSH、GSH-Px水平的影響 ±s，n=10

與正常對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與D-Gal模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.3 各組肝組織病理學改變 HE 染色結果顯示，正常對照組小鼠肝小葉結構清晰，肝細胞結構完整，呈放射狀行走；CCl4及D-Gal模型組小鼠肝小葉結構消失，肝細胞大片凝固性壞死，并伴有炎性細胞浸潤，中央靜脈不規則擴張；與相應模型組比較，SZZJYE各劑量組肝組織病理形態學改變較模型組均有明顯改善，且SZZJYE高劑量組改善更為明顯，見圖1。

圖1 肝組織HE染色圖（×200）

2.4 各組小鼠臟器指數及肝組織PCNA、Bcl-2、Bax蛋白表達量比較 與正常對照組比較，CCl4及DGal模型組肝臟指數、脾臟指數均升高，CCl4模型組PCNA 蛋白表達下降，D-Gal 模型組Bcl-2 蛋白表達量降低，Bax 蛋白表達量升高（P＜0.05）；與相應模型組比較，SZZJYE各劑量組肝臟指數、脾臟指數均降低，肝組織PCNA、Bcl-2 蛋白表達量升高，Bax 蛋白表達量下降（P＜0.05），見圖2、表5、表6。

表5 SZZJYE對CCl4所致急性肝損傷小鼠臟器指數及肝組織PCNA蛋白表達的影響 ±s，n=10

表5 SZZJYE對CCl4所致急性肝損傷小鼠臟器指數及肝組織PCNA蛋白表達的影響 ±s，n=10

與正常對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與CCl4模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

表6 SZZJYE對D-Gal所致急性肝損傷小鼠臟器指數及凋亡相關蛋白表達的影響 ±s，n=10

表6 SZZJYE對D-Gal所致急性肝損傷小鼠臟器指數及凋亡相關蛋白表達的影響 ±s，n=10

與正常對照組比較，△P＜0.01；與D-Gal模型組比較，*P＜0.01。

圖2 肝組織PCNA、Bcl-2、Bax蛋白的免疫組化染色圖（×400）

3 討論

CCl4作為急性肝損傷造模的經典藥物，不僅廣泛用于肝壞死及肝硬化的病因學、組織學研究和肝功能變化研究中，在藥用植物提取物、保肝藥物評價中也應用廣泛[12-13]。D-Gal 建立的急性肝損傷模型，其導致的肝細胞彌漫性壞死和炎癥反應與人類病毒性肝炎極為相似，故常應用于保肝藥物的篩選及作用機制的研究[14]。

ALT、AST 是急性肝損傷的敏感指標[15-16]，當肝臟受損或發生炎癥時，ALP和TBIL升高，TBIL升高會引起黃疸，也是臨床判斷急性肝損是重要依據[17]。CCl4和D-Gal 誘導小鼠肝細胞膜通透性增加，細胞內ALT、AST、ALP 釋放入血，TBIL 含量升高，提示肝臟受到一定損傷，HE染色結果顯示肝組織出現嚴重病理改變，細胞結構被破壞，炎性介質浸潤，肝細胞壞死，急性肝損傷建模成功[18]。本研究中，SZZJYE 均能降低小鼠血清中ALT、AST、ALP活性和TBIL 含量，減輕肝細胞損傷；肝組織HE 染色結果也提示，經過SZZJYE 治療后的小鼠肝臟壞死細胞減少，肝損傷程度有所減輕。

CCl4和D-Gal 誘導小鼠急性肝損傷后，機體氧化—抗氧化系統的失衡導致肝細胞氧化受損[19]，使肝臟SOD和GSH-Px活性喪失；另一方面，肝細胞膜脂質過氧化產生大量過氧化物MDA，進一步加重細胞功能損傷。因此，檢測肝臟中SOD、GSH-Px水平和GSH、MDA含量，可以反映小鼠肝細胞脂質過氧化性損傷的嚴重程度[20]。本實驗結果顯示，SZZJYE 高、中、低劑量組SOD、GSH-Px 的活性和GSH含量提高，MDA含量降低，其中高劑量組效果最優，表明SZZJYE可通過清除自由基、抗脂質過氧化來減輕肝細胞損傷。

肝細胞凋亡也是急性肝損傷的另外一種基本特征[21]。PCNA 是DNA 聚合酶δ 的輔助蛋白，其表達反映了細胞再生功能的程度[22]。Bcl-2 通過阻止線粒體釋放細胞色素C 而抑制細胞凋亡，其同源相關蛋白為Bax，當Bcl-2高表達時，Bax/Bax二聚體解離增多，形成更為穩定的Bax/Bcl-2 異源二聚體，凋亡被抑制[23]。本研究免疫組化結果顯示，CCl4和DGal誘導后，PCNA和Bcl-2蛋白表達量下降，Bax表達量升高，提示模型組小鼠肝細胞進入凋亡狀態；與相應模型組比較，不同劑量SZZJYE 均能上調小鼠肝細胞PCNA和Bcl-2蛋白表達，下調Bax蛋白表達，說明SZZJYE預處理能夠修復肝細胞功能、抑制肝細胞凋亡，從而達到保護肝臟的作用。

綜上，SZZJYE 對小鼠急性肝損傷有一定的保護作用，其機制可能與抑制脂質過氧化、清除自由基、修復肝細胞功能及抗凋亡有關。