二去水衛(wèi)矛醇對人非小細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞體內(nèi)抗癌活性及其機(jī)制研究*

周 瑩，劉華鋼，孫悅文，李健哲，陳清潔，張小軍

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院藥學(xué)部，南寧 530001；2.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530001）

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）發(fā)生率約占肺癌的75%～80%，5年生存率僅8%～15%，手術(shù)、化療、放療是NSCLC 的主要治療手段[1]。傳統(tǒng)化療方案5年總體生存率（OS）改善不理想，且毒副反應(yīng)較多，尋找有效且安全的抗腫瘤藥迫在眉睫。二去水衛(wèi)矛醇（1,2:5,6-dianhydrogalactitol，DAG）是一種以植物衛(wèi)矛醇為原料提取的廣譜抗腫瘤藥，其對白血病有較好的療效，對肺癌、原發(fā)性腦瘤等亦具有一定治療效果[2]。

體外研究發(fā)現(xiàn)，DAG 能有效抑制白血病細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞、乳腺腫瘤細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、腦腫瘤細(xì)胞等，且其機(jī)制與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)[3-7]，但尚未探索DAG 對人NSCLC H460 細(xì)胞體內(nèi)抗癌活性及其作用機(jī)制。本研究通過建立人NSCLC H460細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，探討DAG 對人NCI-H460 肺癌細(xì)胞體內(nèi)抗癌的作用與機(jī)制，為證實(shí)DAG 體內(nèi)抗癌活性、臨床應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物和主要試劑 人NSCLC H460細(xì)胞株購于上海細(xì)胞庫。注射用DAG 購自廣西梧州制藥（集團(tuán)）股份有限公司，批號：131101；注射用順鉑（DDP）購自山東齊魯制藥有限公司。CCK-8 試劑盒（日本DOJINDO 化學(xué)研究所）；TUNEL 原位末端標(biāo)記檢測試劑盒（德國羅氏公司）；RNAiso Plus、RNase Free、DL500DNA Marker、Loading buffer（大連TaKaRa 公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Ⅰ檢測試劑盒（日本Takara公司）；Bax、Bcl-2、P53、GAPDH和HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗均購自美國Santa Cruz公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和裸鼠移植瘤模型的建立 SPF 級BALB/c 裸鼠，4～6 周齡，雌雄各半，體重18～25 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK 京2012-0001；飼養(yǎng)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級動(dòng)物房內(nèi)。

裸鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，取對數(shù)生長期的人NSCL CH460細(xì)胞，消化重懸為單個(gè)細(xì)胞，PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次后，用PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個(gè)/mL。將0.2 mL 細(xì)胞重懸液皮下注射到每只裸鼠右側(cè)前肢腋窩下部的同一部位和深度，待腫瘤體積達(dá)到200 mm3為模型建立成功。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組和給藥 將造模成功后的裸鼠隨機(jī)分為模型組、DAG 低劑量組（DAG-L 組，3 mg/kg）、DAG 中劑量組（DAG-M 組，6 mg/kg）、DAG 高劑量組（DAG-H 組，9 mg/kg）和陽性對照組（順鉑，3 mg/kg），每組6 只。各組均通過腹腔注射給藥，1 次/d，連續(xù)7 d，按0.2 mL/20 g體重計(jì)算藥量，模型組腹腔注射等量生理鹽水。每次給藥前測量裸鼠體重和腫瘤體積（V），V=[1/2×腫瘤長徑（a）×短徑（b）2]。給藥結(jié)束后頸椎脫臼法處死各組裸鼠，剝離移植瘤，稱瘤重，計(jì)算抑瘤率，抑瘤率=（模型組瘤重－給藥組瘤重）/模型組瘤重×100%。

1.4 TUNEL法檢測腫瘤組織細(xì)胞凋亡 取部分腫瘤組織于10%多聚甲醛溶液中固定24 h 后制作石蠟切片，進(jìn)行脫蠟、水合、蛋白酶處理，PBS 漂洗切片，加入TUNEL反應(yīng)液，PBS漂洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，風(fēng)干后中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。每張切片選取5 個(gè)陽性細(xì)胞數(shù)最多的高倍視野（×200），計(jì)數(shù)視野下所有的細(xì)胞數(shù)和陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率，即陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比。

1.5 RT-qPCR 法檢測Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9 和P53 mRNA 相對表達(dá)量 取腫瘤組織，Trizol 法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火、延伸31 s，共40 個(gè)循環(huán)。所有引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，Bax 上游：5’-GACGAACTGGACAGTAACATGGA-3’，下游：5’-GCAAAGTAGAAAAGGGCGACA-3’，產(chǎn)物長度為149 bp；Bcl-2 上游：5’-AACATCGCCCTGTGGATGAC-3’，下游：5’-AGAGTCTTCAGAGACAGCCAGGAG-3’，產(chǎn)物長度為146 bp；Caspase-3上游：5’-GACTCTGGAATATCCCTGGACAACA-3’，下游：5’-AGGTTTGCTGCATCGACATCTG-3’，產(chǎn)物長度為140 bp；Caspase-9 上游：5’-TCCAGGAAGGTTTGAGGACC-3’，下游：5’-CCCTTTCACCGAAACAGCAT-3’，產(chǎn)物長度為230 bp；P53 上游：5’-TTTGAGGTGCGTGTTTGTGC-3’，下游：5’-GCCTCATTCAGCTCTCGGAA-3’，產(chǎn)物長度為366 bp；GAPDH 上游：5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游：5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’，產(chǎn)物長度為138 bp。采用2-△△CT法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。

1.6 Western blotting 法檢測P53、Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá) 將腫瘤組織充分研磨后，加入裂解液充分裂解，離心，取上清液得到蛋白樣品，BCA法測定蛋白濃度，煮沸使蛋白變性；按每孔30 μg 蛋白上樣，電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h；加入一抗P53、Bcl-2、Bax（均1∶1 000）4 ℃冰箱孵育過夜，洗膜，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶10 000）室溫下孵育1 h，洗膜；ECL 顯影液曝光顯影，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DAG對裸鼠移植瘤體積和重量的影響 各組裸鼠的飲食均無明顯異常，模型組裸鼠體重持續(xù)增加，移植瘤體積逐漸增大，而DAG 各劑量組和陽性對照組裸鼠體重和移植瘤體積增加緩慢，見圖1；給藥7 d 后剝離瘤體檢測結(jié)果顯示，與模型組比較，DAG 各劑量組和陽性對照組瘤體體積和瘤重減小（P＜0.05），抑瘤率均高于40%；與陽性對照組比較，DAG-M組、DAG-H組瘤體體積和瘤重減小（P＜0.05）；與DAG-L 組比較，DAG-M 組、DAG-H 組瘤重減小（P＜0.05），見圖2、表1。

表1 各組裸鼠移植瘤體積和重量比較 ±s，n=6

表1 各組裸鼠移植瘤體積和重量比較 ±s，n=6

與模型組比較，*P＜0.05；與陽性對照組比較，#P＜0.05；與DAG-L組比較，&P＜0.05。

圖1 各組不同時(shí)間裸鼠體重和移植瘤體積比較

圖2 給藥7 d后各組腫瘤大小比較

2.2 DAG 對腫瘤細(xì)胞凋亡的影響 與模型組（1.21%±1.05%）比較，DAG-L 組（6.34%±1.67%）、DAG-M組（41.03%±1.96%）組、DAG-H組（75.13%±2.06%）和陽性對照組（18.60%±1.45%）腫瘤細(xì)胞凋亡率均增高（均P＜0.05）；與陽性對照組比較，DAG-M組、DAG-H組腫瘤細(xì)胞凋亡率增高（均P＜0.05）；與DAG-L 組比較，DAG-M 組、DAG-H 組腫瘤細(xì)胞凋亡率增高（均P＜0.05），見圖3。

圖3 各組腫瘤組織TUNEL染色圖（×200）

2.3 DAG對腫瘤組織凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

與模型組比較，DAG-M組、DAG-H組和陽性對照組Bax、Caspase-3、Caspase-9、P53 mRNA 相對表達(dá)量升高，DAG-L 組Caspase-9 mRNA 相對表達(dá)量升高，DAG 各劑量組Bcl-2 mRNA 相對表達(dá)量均降低（均P＜0.05）；與陽性對照組比較，DAG-H 組Bax、Caspase-3、Caspase-9、P53 mRNA 相對表達(dá)量升高，DAG-M組Bax、Caspase-9 mRNA相對表達(dá)量升高，DAG-L組和DAG-H組Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量降低（均P＜0.05）；與DAG-L組比較，DAG-M組、DAG-H 組Bax、Caspase-3、Caspase-9、P53 mRNA 相對表達(dá)量升高，DAG-H組Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量降低（均P＜0.05），見表2。

表2 各組腫瘤組織Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、P53 mRNA相對表達(dá)量比較 ±s，n=6

表2 各組腫瘤組織Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、P53 mRNA相對表達(dá)量比較 ±s，n=6

與模型組比較，*P＜0.05；與陽性對照組比較，#P＜0.05；與DAG-L組比較，&P＜0.05。

2.4 DAG對腫瘤組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與模型組比較，DAG各劑量組Bax、P53蛋白相對表達(dá)量升高，Bcl-2 蛋白相對表達(dá)量降低（均P＜0.05）；與陽性對照組比較，DAG-M 組、DAG-H 組Bax、P53 蛋白相對表達(dá)量升高，DAG-L 組Bax 蛋白相對表達(dá)量升高，DAG 各劑量組Bcl-2 蛋白相對表達(dá)量降低（均P＜0.05）；與DAG-L 組比較，DAG-M組、DAG-H 組P53 蛋白相對表達(dá)量升高（均P＜0.05），見圖4、表3。

表3 各組腫瘤組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量比較 ±s，n=6

表3 各組腫瘤組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量比較 ±s，n=6

與模型組比較，*P＜0.05；與陽性對照組比較，#P＜0.05；與DAG-L組比較，&P＜0.05。

圖4 Western blotting蛋白電泳圖

3 討論

DAG是新型的植物生物堿類抗腫瘤藥，為廣譜抗腫瘤藥物，具有毒性小、易溶于水、抗腫瘤活性高等優(yōu)點(diǎn)。該藥目前已經(jīng)上市，并主要用于治療慢性粒細(xì)胞白血病，其主要的作用機(jī)制是通過本身或派生的環(huán)氧基團(tuán)的烷基化作用，使DNA 烷基化，從而抑制DNA 合成，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，推測的作用機(jī)制還包括抑制RNA和蛋白質(zhì)合成[8]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，DAG 各劑量組腫瘤細(xì)胞凋亡率增高，且DAG-H 作用最顯著。初步說明了DAG 在裸鼠體內(nèi)可誘導(dǎo)H460肺癌細(xì)胞凋亡。

經(jīng)典的細(xì)胞凋亡途徑主要有3 條：細(xì)胞內(nèi)的線粒體途徑、細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑及細(xì)胞表面的死亡受體途徑[9]。與凋亡相關(guān)的基因有很多，研究較多的是抑癌基因P53、Bcl-2家族和Caspase家族[10]。其中P53 基因是一個(gè)強(qiáng)大的“基因組衛(wèi)士”，它不僅能夠調(diào)節(jié)大約200余種與細(xì)胞周期凋亡、自噬、衰老等密切相關(guān)的下游蛋白表達(dá)[11]，還能夠激活凋亡效應(yīng)分子而誘導(dǎo)凋亡。Bax 和Bcl-2 同屬于Bcl-2 家族，主要是線粒體途徑中控制凋亡因子釋放的主要調(diào)節(jié)者[12]，在P53 的刺激下，凋亡因子Bax 表達(dá)上調(diào)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；反之，抗凋亡因子Bcl-2過表達(dá)可以阻止細(xì)胞調(diào)亡[13-14]。Caspase家族是直接導(dǎo)致凋亡細(xì)胞死亡的蛋白酶系統(tǒng)，在細(xì)胞凋亡過程中起著關(guān)鍵性作用，其中Caspase-3、Caspase-9 作為凋亡信號傳遞通路的匯聚點(diǎn)，可被多種凋亡信號激活，參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控[15-16]。賴祥進(jìn)等[17]研究發(fā)現(xiàn)，二乙酰二脫水衛(wèi)矛醇通過促進(jìn)P53基因表達(dá)對肝癌細(xì)胞的生長發(fā)揮抑制作用；楊錦南等[18]研究發(fā)現(xiàn)，二乙酰二脫水衛(wèi)矛醇可在體內(nèi)誘導(dǎo)白血病HL-60 細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與Bcl-2 蛋白表達(dá)下調(diào)、Bax 蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)；鄧曉慧等[19]研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-3 在乙酰二脫水衛(wèi)矛醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起重要作用。

本研究在明確了DAG在裸鼠體內(nèi)誘導(dǎo)人NCIH460 肺癌細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)上，通過RT-qPCR 和Western blotting法檢測腫瘤組織細(xì)胞凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)變化，初步探討DAG在體內(nèi)可能的促凋亡機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DAG-M、DAG-H 可誘導(dǎo)Bax、Caspase-3、Caspase-9、P53表達(dá)明顯上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)。結(jié)果提示DAG 作用后可能激活了細(xì)胞凋亡的線粒體途徑，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，與陽性對照順鉑相比，DAG-M、DAG-H腫瘤組織TUNEL 陽性凋亡率增高。提示DAG 抗腫瘤、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的效果可能優(yōu)于作為NSCLC 一線治療用藥的順鉑，但仍有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，DAG 能有效抑制裸鼠NSCLC 的生長，其機(jī)制可能與誘導(dǎo)線粒體凋亡途徑相關(guān)。本組將深入探討DAG誘導(dǎo)裸鼠體內(nèi)人NSCLC凋亡的機(jī)制，并通過構(gòu)建其他腫瘤裸鼠皮下移植瘤模型觀察DAG 體內(nèi)抑制多種腫瘤的作用及其分子機(jī)制，為DAG的臨床應(yīng)用、增加適應(yīng)證提供可靠的依據(jù)。