16q缺失調節miR-3145-5p/CYP2E1表達對肝癌細胞增殖、遷移和凋亡及患者預后的影響*

邱龍鳳，盧玉飛，吳圣明，木和·穆罕默德，胡啟平,3△

（1.廣西醫科大學基礎醫學院細胞生物學與遺傳學教研室，南寧 530021；2.廣西醫科大學附屬腫瘤醫院影像診斷中心，南寧 530021；3.廣西醫科大學長壽與老年相關疾病教育部重點實驗室，南寧 530021）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一種起源于肝細胞、最常見的肝臟惡性腫瘤，但其發病機制尚不清楚[1]。染色體片段缺失是人類實體癌的共同特征，其缺失通常代表了駐留在缺失區域內的特定腫瘤抑制基因失活[2]。已有研究表明，癌癥患者的染色體缺失與患者的不良結局之間存在密切的聯系[3]。其中染色體16q 片段不同程度的缺失在多種癌癥中均有發現，但其具體影響機制尚不明確。本課題組前期研究發現，75 例廣西HCC 患者中有約50%的患者癌組織中存在16q 缺失，但未對16q 缺失影響HCC 發生發展的機制作進一步的分析[4]。miRNA 是一種非編碼小RNA，參與細胞增殖、新陳代謝、分化和凋亡等關鍵生物學過程的調節[5]，在HCC 診斷、預后和治療等方面發揮的作用已被證明。然而，16q 缺失及其差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）在HCC 中的研究尚未深入。本研究旨在探索HCC 中16q 缺失對患者預后的影響及其相關的miRNAs和關鍵DEGs，為臨床HCC的治療和預后提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 TCGA數據收集 從TCGA數據庫中獲取TCGA-LIHC 數據集，包含全轉錄組數據（372 個HCC樣本和50 個非腫瘤樣本）和16q CNV 數據（缺失片段篩選閾值為Mean_Log_Ratio≤-0.25）[6-7]。

1.2 miRNAs 及關鍵靶基因的篩選 基于TCGALIHC 全轉錄組數據，使用DECenter 篩選出與HCC 16q 缺失相關的miRNAs 和DEGs。通過miRWalk(http://miRwalk.umm.uni-heidelberg.de/)預測miRNAs 與關鍵DEGs 的表達調節關系。在TCGA-LIHC 數據庫和Kaplan-Meier Plotter 數據庫中獲取關鍵DEGs 在HCC 中的表達圖譜以及對患者生存影響圖譜。

1.3 免疫組織化學染色法檢測關鍵蛋白表達水平

根據HPA 數據庫獲取HCC 患者癌組織及其癌旁組織關鍵蛋白（CYP2E1）的免疫組織化學染色圖，按照組織化學評分法（H-score）進行評分，Hscore=∑pi（i+1），其中pi 為陽性細胞數占切片中所有細胞數量的百分數，i代表著色強度。

1.4 細胞培養和轉染 人肝癌細胞株Huh7（中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫）用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養基，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。將miRNA 過表達（mimic）慢病毒載體LV-hsa-miR-3145-5p、對照慢病毒載體con294（上海吉凱基因科技有限公司）分別轉染HCC 細胞株，即miR-3145-5p mimic組、NC-con294組。

1.5 實時熒光定量PCR（RT-qPCR） 提取細胞總RNA，miRNA 采用加尾法進行逆轉錄，mRNA 逆轉錄采用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）試劑盒。定量試劑均采用TB Green? Premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa）試 劑 盒。GAPDH用作待測基因的內參，U6用作miRNA的內參。采用2-ΔΔCt法計算miRNA/mRNA 相對表達量。引物序列如下：miR-3145-5p上游：5’-CGCGAACTCCAAACACTCAAAACTCA-3’；U6 上游:5’-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3’；所有通用下游引物均由TaKaRa公司提供。

1.6 Western blotting法檢測CYP2E1蛋白表達

細胞貼壁長滿后，使用RIPA Lysis Buffer 裂解細胞，冰上裂解30 min 后，12 000 r/min 離心5 min，收集上清；采用BCA 法測定蛋白濃度，煮沸變性，SDS-PAGE電泳分離蛋白，將蛋白轉移至PVDF膜；5%脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗CYP2E1（1∶1 000，Abcam）、β-actin（1∶1 000，Absin）4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次，二抗（1∶5 000，Absin）室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次，ECL 顯色、曝光，蛋白凝膠成像儀（SGC2020126，ChampChemi 610 Plus）進行顯影，保存圖像后，用Image J軟件進行定量分析。

1.7 CCK-8法檢測細胞增殖 細胞計數后，將轉染后的Huh7細胞株（3×103個/孔）接種于96孔板，按照CCK-8試劑盒說明書操作，用酶標儀檢測450 nm波長處各孔的吸光度值。

1.8 細胞克隆形成實驗 將穩定轉染的Huh7細胞株接種于6孔板中（1×103個/孔），置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，培養皿中出現肉眼可見的克隆團時終止培養。使用4%組織細胞固定液和結晶紫溶液，按照試劑說明書對細胞克隆團進行染色，晾干后進行計數并分析。

1.9 細胞侵襲實驗 向Transwell小室中加入200 μL用新鮮無血清培養基稀釋的Huh7 細胞（3×104個/孔），下室中加入600 μL含10%FBS完全培養基，并置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h。使用4%組織細胞固定液和結晶紫溶液，按照試劑說明書對小室進行染色。計算侵襲細胞數。

1.10 細胞劃痕實驗 取對數生長期細胞并計數，將轉染后的Huh7細胞株（1.5×106個/孔）接種于6孔板，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，待細胞平鋪長滿后進行劃痕，并于同一位置不同時間段（0 h 和24 h）進行拍照，計算劃痕愈合率，劃痕愈合率=（0 h劃痕面積－24 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。

1.11 細胞周期和細胞凋亡檢測 取對數生長期、生長狀態良好的細胞，分別按照細胞周期檢測試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司）和細胞凋亡檢測試劑盒（MULTI SCIENCES）說明書步驟，采用流式細胞儀進行檢測和分析。

1.12 統計學方法 采用SPSS 20.0 統計軟件對數據進行處理，正態分布的資料組間比較采用t檢驗，偏態分布的資料采用秩和檢驗；以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 320 個DEGs 與16q 缺失和腫瘤發生、發展相關 根據TCGA-LIHC數據集中16q CNV數據和全轉錄組數據，篩選出320個與16q缺失和腫瘤發生、發展相關（相對于癌旁組織，在癌組織中上調或下調的基因）的DEGs（其中169 個上調、151 個下調），其中19個DEGs位于16q上，且均為下調DEGs（表1）。通過DAVID 對DEGs 進行KEGG 通路富集分析，綜合考慮P值和富集倍數，發現其主要富集于“細胞色素氧化酶P450代謝有害異物”、“化學致癌”和“藥物代謝—細胞色素氧化酶P450”通路（圖1A），相關DEGs 包 括UGT2B10、GSTM1、UGT1A1、ADH1C、ADH1B、UGT2B15、UGT2B17、CYP3A4、HSD11B1、ADH4、AKR7A3、GSTA2、CYP1A2、CYP1A1、UGT1A4、UGT1A3、CYP2E1、UGT2B7、UGT2B10、NAT2和AOX1；然而，16q 上所有DEGs 并不在上述通路中。進一步分析DEGs中細胞色素氧化酶P450表達發現，當16q 缺失時13 種CYP 中有9 種表達下調（CYP11A1、CYP2A6、CYP 17A1、CYP2E1、CYP1A1、CYP8B1、CYP3A4、CYP1A2和CYP39A1），即16q缺失可能通過減弱有害異物的代謝使細胞表型更加惡化。

表1 16q上與16q缺失相關基因的差異表達

利 用Cytoscape、MCODE 和cytoHubba 分 析DEGs 之間相互作用關系發現12 個關鍵基因（圖1B）存在較強的相互作用關系，其中下調關鍵DEGs（CYP3A4、UGT1A1、CYP2E1、AOX1和CYP1A1）中有3 個是CYP（表2）。隨后，根據TCGA-LIHC 與Kaplan-Meier Plotter 數據庫，將CYP2E1 在HCC 患者癌組織和正常（癌旁）組織中相對表達水平以及對患者的生存影響進行了分析，與癌旁組織比較，HCC 癌組織CYP2E1 mRNA 相對表達量降低（圖1C）；HPA數據庫免疫組織化學結果顯示，與癌旁組織比較，CYP2E1 蛋白表達在HCC 組織中下調（圖1D）。生存分析顯示，在HCC患者中，CYP2E1低表達組患者生存率低于CYP2E1高表達組（圖1E）。

表2 Cytoscape、MCODE 和CytoHubba 分析16q 缺失相關DEGs的關鍵基因

圖1 16q缺失相關DEGs通路分析和DEG（CYP2E1）表達及其對患者預后的影響

2.2 miR-1226-3p、miR-3145-5p可能調控CYP3A4、CYP2E1表達根據TCGA-LIHC 中miRNA 和CNV 數據，篩選出8 個16q 缺失相關的差異表達miRNAs（miR-483-5p、miR-483-3p、miR-3145-5p、miR-1226-3p、miR-378d、miR-4788、miR-204-3p 和miR-204-5p），其中miR-483-5p、miR-483-3p、miR-3145-5p 和miR-1226-3p 表達上調、miR-378d、miR-4788、miR-204-3p 和miR-204-5p 表達下調；進一步用miRWalk 篩選上述miRNAs 的靶基因，預測結果發現16q 缺失后CYP3A4 和CYP2E1 等2 個關鍵DEGs可能與miR-1226-3p 和miR-3145-5p 等2 個DEmiRs存在表達調節關系。

根據CYP的平均表達值（AveExpr）、DEmiRs篩選時的效應量（effect size）、P值和靶基因的預測關系，本選擇miR-3145-5p和CYP2E1的表達調控關系及其對HCC 細胞行為的影響來驗證16q 缺失對HCC預后的影響。

2.3 miR-3145-5p mimic 對miR-3145-5p 基因和CYP2E1 蛋白表達的影響與NC-con294 組比較，miR-3145-5p mimic 組miR-3145-5p 表達 上調，CYP2E1 的蛋白表達水平下調（P＜0.01），見圖2。

圖2 miR-3145-5p mimic對miR-3145-5p基因和CYP2E1蛋白表達的影響

2.4 miR-3145-5p mimic 對Huh7 細胞增殖和細胞周期的影響 在miR-3145-5p mimic轉染Huh7細胞后，與NC-con294 組比較，miR-3145-5p mimic 組細胞增殖和侵襲能力增強，細胞凋亡率升高（均P＜0.01），沒有發現明顯的細胞周期阻滯現象，兩組細胞遷移能力比較亦無明顯差異（P＞0.05），見圖3、圖4。

圖3 miR-3145-5p mimic對Huh7細胞增殖和細胞周期的影響

圖4 miR-3145-5p mimic對Huh7細胞侵襲、遷移和凋亡的影響

3 討論

HCC 是全球癌癥死亡的常見原因，其基因組、表觀遺傳和轉錄改變對HCC的發生發展、轉移和預后發揮著關鍵作用[8-9]。另外，16q 片段不同程度的缺失已在KBG綜合征[10]、乳腺癌[11]、前列腺癌[12]等多種癌癥中出現，并且在癌癥的發生發展和預后中發揮了一定作用，然而目前尚未在分子水平上對16q缺失與HCC的發生發展關系進行探討。

有496個基因定位于16q 上，但在16q缺失的患者癌組織中，只有其中19 個基因發生了差異表達（均為下調表達）。本研究篩選出320個與16q缺失相關的DEGs，這些DEGs 主要富集于“細胞色素氧化酶P450代謝有害異物”、“化學致癌”和“藥物代謝—細胞色素氧化酶P450”通路，但16q 上的19 個DEGs 均未在上述通路中，可見16q 缺失影響HCC細胞的表型可能是通過影響16q以外基因（如CYP）表達來實現的。與16q缺失相關的13種CYP中有9種表達下調，并且其中3 種（CYP3A4、CYP2E1和CYP1A1）下調CYPs 是蛋白-蛋白相互作用較強的hub基因。

CYP2E1 是一種Ⅰ相毒物代謝酶，參與藥物代謝以及大腦生物活性過程，具有解毒作用，與多種疾病和病理生理狀況有關[13]，其中，較高的CYP2E1活性與二乙基亞硝胺誘導的HCC發生相關，而抑制CYP2E1 活性可降低DEN 對肝細胞的增殖、肝損傷和HCC 的發生[14]。本研究根據TCGA-LIHC、HPA和Kaplan-Meier Plotter 等數據庫分析發現，相對于正常組織，HCC 癌組織中CYP2E1在mRNA 和蛋白水平表達都是下調的，且CYP2E1低表達對患者的生存是不利。CYP3A4 是CYP3A 亞家族中研究最多的異構體，負責CYP3A 亞家族的大部分代謝活動，免疫反應性強，分布范圍廣，是當前HCC治療的預后標志[15-16]。因此，16q 缺失可能通過下調CYP2E1和CYP3A4表達來減弱有害異物的代謝使細胞表型更加惡化。

隨后篩選出8 個16q 缺失相關的DEmiRs，并預測其中miR-3145-5p 與CYP2E1、miR-1226-3p 與CYP3A4和CYP2E1存在表達調節關系。已有研究表明，miR-1226-3p 通過下調DUSP4 表達促進HCC索拉非尼敏感性[17]，還可調節ITGB1進而促進HCC細胞增殖和侵襲[18]。而miR-3145-5p在HCC中的作用及機制目前尚無研究報道。經本研究推測，16q缺失可能通過miR-3145-5p、miR-1226-3p 下調CYP2E1和CYP3A4表達使細胞表型更加惡化，進而使HCC患者預后不良。

根據CYP的表達值和DEmiRs篩選時的效應量P值等因素，本研究選擇miR-3145-5p和CYP2E1的表達調控關系及其對HCC 細胞行為的影響來驗證16q 缺失對HCC 預后和生存的影響。實驗結果表明，HCC 細胞中miR-3145-5p 可在mRNA 和蛋白水平下調CYP2E1的表達，并促進HCC 細胞的增殖和侵襲；在對細胞凋亡的影響方面，miR-3145-5p mimic 可使細胞凋亡增加，但可能細胞增殖速度相較于細胞凋亡的速率快，故細胞總體呈增殖狀態，此效應對HCC 細胞的惡性表型的影響有待進一步研究。結合CYP2E1的功能及其表達對患者生存的影響以及miR-3145-5p和CYP2E1的表達調節關系，本組推測在16q 缺失的HCC 患者中，上調的miR-3145-5p 和miR-1226-3p 等miRNAs 可能靶向下調CYP2E1和CYP3A4的表達，尤其是miR-3145-5p 通過下調CYP2E1表達來促進HCC 細胞的增殖和侵襲而進一步增加細胞的惡性表型，促進HCC 發展，降低患者預后。

為了更進一步了解16q 缺失與HCC 發生發展的相關機制，還應進一步在熒光素酶實驗、更多HCC 細胞系（株）和在動物水平上分析miR-1226-3p、miR-4788 和miR-378d 等miRNAs 與CYP2E1和CYP3A4的表達調節關系及其對HCC惡性生物學行為的影響，為HCC 的診斷、治療提供更加有效的依據。

總之，本研究通過綜合生物信息學分析對16q缺失相關的差異表達miRNAs及差異表達基因進行篩選，并通過基因、蛋白水平以及細胞水平對其進行驗證，發現16q 缺失可能增強HCC 相關miRNAs（miR-1226-3p、miR-3145-5p）及其靶基因（CYP3A4和CYP2E1）的表達調控，進而影響HCC細胞的惡性生物學行為，導致HCC 患者的不良預后。綜上所述，DEGs（CYP2E1和CYP3A4）和DEmiRs（miR-1226-3p 和miR-3145-5p），尤其是miR-3145-5p 和CYP2E1，可能是預測HCC 患者16q 缺失預后的生物分子標志物，可作為16q缺失HCC患者潛在的治療靶點。