基于Notch1通路研究白藜蘆醇對脂多糖誘導HT-29細胞緊密連接蛋白損傷的作用及機制*

羅毅華，張君紅，劉 瑩，井 潔，黃 雪

（廣西醫科大學附屬第一醫院老年病學消化內科，南寧 530021）

腸屏障功能的異常在潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis,UC）的發病過程中扮演著重要角色，其中腸上皮緊密連接蛋白是腸屏障功能維持的最重要因素[1]。研究表明，腸上皮緊密連接蛋白的異常表達可促進UC 疾病的發展[2-3]，Notch1 通路因能影響腸上皮緊密連接蛋白表達從而成為了人們的研究熱點[4-6]。白藜蘆醇（resveratrol,RSV）作為一種天然多酚化合物，廣泛存在花生、葡萄、桑葚等植物中，其已被證實具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗動脈粥樣硬化等作用[7-9]。在UC 的臨床前期研究中，RSV 作為一種補充劑，可有效緩解UC 患者的臨床癥狀[10-11]；在UC 相關實驗研究中，RSV 可通過抑制Notch1 通路活性調節人結腸上皮細胞的增殖和分化，從而對UC的細胞模型具有保護作用[12]。另外有研究證實，RSV可上調腸上皮緊密連接蛋白的表達，從而緩解UC動物模型的腸道炎癥[13-14]，然而RSV調控腸上皮緊密連接蛋白表達的機制尚存在爭議，且RSV是否通過Notch1 通路調節腸上皮緊密連接蛋白的表達目前尚不清楚。因此本研究擬通過脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導HT-29 細胞構建腸上皮緊密連接蛋白損傷模型（HT-29 細胞損傷模型），探討RSV 對腸上皮緊密連接蛋白的影響及是否通過Notch1 通路參與調控，為尋找治療UC 的新藥物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

HT-29細胞購買于中國科學院上海生物化學和細胞生物學研究所細胞資源中心，細胞在含10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素溶液的RPMI-1640培養基中培養，置于含5%CO2、溫度為37 ℃的濕潤培養箱中培養。當細胞長至80%～90%融合度時，將其按照1∶3比例進行傳代培養，用于后續實驗。

1.2 藥物試劑

LPS，購于美國sigma公司；1%青霉素鏈霉素溶液，購于蘇州新賽美生物科技有限公司；胎牛血清、RMPI-1640 培養基購于Biological Industries 公司，RSV、γ-分泌酶抑制劑（DAPT），購于美國APE 公司；CCK-8 試劑盒，購于中國大連美倫生物公司；claudin-1、Notch1、Hes1 抗體購于美國Abcam 公司，occludin、ZO-1、抗兔IgG 抗體購于美國cell Signaling Technology公司。

1.3 細胞分組及處理

當細胞長至80%～90%融合度時，將細胞傳至6孔板繼續培養，待6孔板內細胞長至70%左右融合度時，更換無血清培養基培養過夜使細胞同步化，隨后將細胞分為對照組，LPS 組（100 μg/mL 的LPS干預24 h），RSV 低劑量組（50 μmol/L 的RSV 預處理HT-29 細胞4 h，隨后加入100 μg/mL 的LPS 繼續干預24 h），RSV 高劑量組（100 μmol/L 的RSV 預處理HT-29 細胞4 h，隨后加入100 μg/mL 的LPS 繼續干預24 h），Notch1 通路抑制劑組（以下簡稱DAPT組，20 μmol/L 的DAPT 預處理HT-29 細胞4 h，隨后加入100 μg/mL的LPS繼續干預24 h）。

1.4 CCK-8法檢測細胞活力

使用CCK-8法檢測藥物對細胞活力的影響，將HT-29 細胞以5 000 個/孔的密度接種于96 孔板，每組5 個復孔。待細胞長至70%左右的融合度時，不同濃度LPS（0.1 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL）、RSV（25 μmol/L、50 μmol/L、75 μmol/L、100 μmol/L）、DAPT（5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L、25 μmol/L）分別作用細胞24 h，隨后，用完全培養基將其洗滌2 次，加入含10% CCK-8 的完全培養基，在37 ℃條件下避光孵育，2 h 后將其置于450 nm 波長的酶標儀下測定其吸光度值。

1.5 Western blotting檢測蛋白表達

收集各組細胞后，使用含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液在冰上裂解HT-29 細胞30 min，隨后在4 ℃的條件下，12 000 r/min，離心15 min。將其上清液轉移至另一無菌EP 管，用BCA 法測定各組蛋白濃度。每組樣本中等量的蛋白用12% SDS-PAGE 膠分離各蛋白，并將其蛋白轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。隨后，用含5%的脫脂牛奶于室溫下封閉PVDF 膜1 h。用TBST 緩沖液清洗PVDF 膜后，將膜放至用抗體稀釋液按比例稀釋過后的一抗occludin（1∶1 000）、ZO-1（1∶1 000）、claudin-1（1∶2 000）、Notch1（1∶2 000）、Hes1（1∶1 000）中，在4 ℃條件下孵育過夜。將PVDF膜從一抗中取出，TBST緩沖液清洗干凈，隨后放置抗兔IgG（1∶20 000）的二抗中室溫避光孵育1 h。二抗孵育結束后，用TBST緩沖液避光清洗，隨后將膜放置Odyssey 雙色紅外熒光成像系統中進行顯影，用Image J軟件對其數據進行分析。

1.6 統計學方法

用SPSS 22.0 軟件對實驗數據進行統計學分析，用GraphPad Prism 9.0 繪制統計圖。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較時，若方差齊，則采用LSDt檢驗；若方差不齊，則采用塔姆黑尼檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 檢測對HT-29細胞活力無影響的藥物濃度

與對照組相比，LPS、RSV和DAPT濃度分別為100 μg/mL、100 μmol/L和20 μmol/L時，對HT-29細胞活力均無影響，見圖1。為使后續的實驗結果并非由藥物誘導細胞死亡所引起，故LPS 濃度選用100 μg/mL，RSV 選擇在100 μmol/L 的濃度范圍內，DAPT濃度選用20 μmol/L。

圖1 藥物對HT-29細胞活力的影響

2.2 RSV 上調LPS 誘導的HT-29 細胞損傷模型緊密連接蛋白occludin、ZO-1、claudin-1的表達

與對照組相比，LPS 誘導的HT-29 細胞損傷模型緊密連接蛋白occludin、ZO-1、claudin-1的表達水平降低（P＜0.05）。與LPS 組比較，RSV 低劑量組、RSV 高劑量組緊密連接蛋白occludin、ZO-1、claudin-1的表達水平升高（P＜0.05）。當RSV干預濃度為100 μmol/L 時，其上調LPS 誘導的HT-29 細胞損傷模型緊密連接蛋白occludin、ZO-1、claudin-1表達的效果最為明顯，見圖2，故后續采用100 μmol/L的RSV進行機制研究。

圖2 RSV對LPS誘導的HT-29細胞損傷模型緊密連接蛋白occludin、ZO-1、claudin-1的影響

2.3 RSV 抑制LPS 誘導的HT-29 細胞損傷模型Notch1通路的活性

與對照組相比，LPS 組的Notch1、Hes1 蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與LPS 組相比，RSV 低劑量組、RSV 高劑量組Notch1、Hes1 蛋白的表達水平降低（P＜0.05），并且RSV高劑量組更為明顯，見圖3。

圖3 RSV對LPS誘導的HT-29細胞損傷模型中Notch1通路的影響

2.4 RSV 通過抑制Notch1 通路活性上調LPS 誘導的HT-29細胞損傷模型緊密連接蛋白occludin、ZO-1、claudin-1的表達

與對照組相比，LPS 組Notch1、Hes1 蛋白表達水平升高（均P＜0.05）；與LPS 組相比，RSV 組和DAPT 組的Notch1、Hes1 蛋白的表達水平降低，緊密連接蛋白occludin、ZO-1、claudin-1的表達水平升高（均P＜0.05），見圖4～圖5。

圖4 DAPT對LPS誘導的HT-29細胞損傷模型中Notch1通路的影響

圖5 DAPT對LPS誘導的HT-29細胞損傷模型緊密連接蛋白occludin、ZO-1、claudin-1的影響

3 討論

本研究結果顯示，在LPS 構建緊密連接蛋白損傷模型中，RSV 上調了腸上皮緊密連接蛋白occludin、ZO-1、claudin-1 的表達，抑制了Notch1 通路活性，且具有一定的劑量依賴性，當RSV 的濃度為100 μmol/L 時，其上調腸上皮緊密連接蛋白occludin、ZO-1、claudin-1 等表達效果及抑制Notch1 通路活性的效果與Notch1 通路特異性抑制劑DAPT 的效果均無統計學差異，表明RSV可通過抑制Notch1通路活性來上調腸上皮緊密連接蛋白occludin、ZO-1、claudin-1的表達。

Notch1 通路是一種細胞間高度保守的信號通路，通過調控其下游的Hes-1 等基因的表達參與細胞分化、存活及凋亡的信號轉導，在腸上皮緊密連接蛋白的穩定維持中扮演著重要角色。在本研究中，與LPS 組 相 比，Notch1 通 路 分 別 在RSV 和DAPT的作用下，其活性受到一定程度的抑制，腸上皮緊密連接蛋白occludin、ZO-1、claudin-1的表達上調，即Notch1通路活性在一定程度上抑制可上調緊密連接蛋白的表達，這與2014 年的研究觀點“敲除小鼠體內Notch1基因后，因腸上皮緊密連接蛋白表達紊亂而在葡聚糖硫酸鈉喂養后小鼠表現出更為嚴重的腸道炎癥”不符[5]，其中存在的可能性是：Notch1通路在腸上皮細胞的增殖、重建上扮演著關鍵角色[15]，Notch1 基因的完全敲除使得Hes1 等蛋白表達受阻，從而導致腸上皮細胞的增殖、更新和重建功能受阻，腸上皮緊密連接蛋白的表達下降，在葡聚糖硫酸鈉等因素刺激后小鼠腸道炎癥進一步加重；而在本研究中，通過CCK-8 法明確了當RSV 濃度為100 μmol/L、Notch1 通路特異性抑制劑DAPT濃度為20 μmol/L時，二者對HT-29細胞活力均無影響，說明RSV作用濃度為100 μmol/L、DAPT作用濃度為20 μmol/L 時，既抑制了Notch1 通路活性，又不影響HT-29 細胞的增殖、更新和重構，因此不影響HT-29細胞在遭受LPS的誘導損傷后，HT-29細胞自身的增殖修復過程，從而在Notch1通路活性受到抑制后，對腸上皮緊密連接蛋白occludin、ZO-1、claudin-1 起到一定的上調作用；另一方面相關研究證實，Notch1通路活性得到抑制后，TNF-α等促炎因子的分泌減少[16]，而TNF-α 等促炎因子可下調腸上皮緊密連接蛋白的表達[17]，Notch1 通路活性受到抑制后可能通過減少了促炎因子的分泌，從而減輕了其對腸上皮緊密連接蛋白的損害作用。

綜上所述，在LPS 誘導的HT-29 細胞緊密連接蛋白損傷模型中，RSV 上調腸上皮緊密連接蛋白occludin、ZO-1、claudin-1 表達，其機制可能與抑制Notch1 通路活性有關，為RSV 用于臨床治療UC 提供了實驗理論依據。