光老化人角質形成細胞模型的構建*

羅秀玲，周 源，趙斌斌，黃曼麗，李季超，李文宇，范潤哥，溫斯健，林有坤

（1.廣西醫(yī)科大學附屬武鳴醫(yī)院皮膚性病科，南寧 530100；2.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚性病科，南寧 530021；3.廣西鶴蘭墨科技股份有限公司，南寧 530000；4.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院皮膚性病科，南寧 530021）

皮膚老化包括內(nèi)源性老化和外源性老化，內(nèi)源性老化是由遺傳因素調控并隨時間推移導致機體功能逐漸衰退的自然老化過程；外源性老化是由外界因素包括紫外線輻射、壞境污染、飲食、吸煙、壞境等引起的皮膚過早老化的過程，紫外線輻射是引起的皮膚老化的主要外界因素，長期紫外線照射引起的老化即光老化[1]。中波紫外線（UVB）照射皮膚后誘導皮膚細胞產(chǎn)生活性氧自由基（ROS），過量的ROS會打破細胞自身抗氧化系統(tǒng)的平衡，進而引起氧化應激[2]。細胞內(nèi)的氧化指標是評估氧化應激的重要指標。細胞在接受紫外線輻射后同樣會產(chǎn)生大量的炎癥因子，其中白細胞介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）功能廣泛，不僅能導致皮膚局部的炎性反應，還能引起全身的炎性反應[3]。UVB 除了導致光老化，還引起其它光線性皮膚病，也與系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）等結締組織病、惡性黑色素瘤等皮膚惡性腫瘤相關。

近年來，隨著人們對皮膚美容的重視，抗皮膚光老化的研究成為熱點之一，防曬、曬后修復等是抗皮膚光老化的主要手段，目前越來越多的中草藥成分也被用于抗光老化的研究，且許多中草藥被證實具有抗氧化、抗炎的作用，可以達到很好的抗光老化的效果。為更好地進行中草藥抗光老化的研究，首先需要構建UVB輻射后的人角質形成細胞的光老化模型，同時研究引起老化的機制。因此，為獲得用于研究光老化的細胞模型，本實驗以HaCaT細胞為研究對象，以不同輻射劑量的UVB 照射細胞，初步探討引起光老化的機制，為抗皮膚光老化作用的研究提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞 人永生化角質形成細胞株（Ha-CaT）購于武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2 主要試劑 DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶-EDTA 消化液均購于美國Gibco 公司；DMSO溶液購于美國Sigma公司；PBS緩沖液、青鏈霉素混合溶液（100X）購于索萊寶中國公司。

1.1.3 主要儀器 超凈工作臺（蘇州凈化公司）；CO2細胞培養(yǎng)箱、-80 ℃低溫冰箱、酶標儀（美國Thermo 公司）；UVB 輻照儀（G8T5E，312 nm，日本Sankyo公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將HaCaT細胞復蘇，在超凈工作臺上將細胞懸液移入25 T培養(yǎng)瓶中，加入完全培養(yǎng)基至5 mL，使細胞分布均勻后置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至貼壁；待細胞生長至80%～90%進行細胞傳代；需要長期凍存的細胞用1 mL凍存液懸浮，并將細胞懸液移入內(nèi)旋凍存管中，置于程序降溫盒在-80 ℃冰柜中梯度降溫24 h 后，再轉移至液氮罐中長期保存。

1.2.2 建立光老化模型 HaCaT 細胞接種于96 孔板，培養(yǎng)至密度為80%左右，設置空白組、實驗組，每組設置3個復孔取均值。空白組HaCaT細胞不予UVB 照射；實驗組HaCaT 細胞用不同輻射劑量UVB照射，照射劑量（mj/cm2）=照射功率（mw/cm2）×時間（s），照射劑量分別為30 mj/cm2、60 mj/cm2、90 mj/cm2，繼續(xù)孵育24 h 后應用CCK-8 法檢測細胞的增值率，在酶標儀測定A450。計算細胞的相對活力。

1.2.3 光老化細胞模型的相關因子的檢測 將細胞設置為空白組、模型組，每組3 個復孔，并分別進行處理。空白組加入新的培養(yǎng)液，不予UVB 照射；模型組加入新的培養(yǎng)液后予以篩選出的UVB 輻射劑量照射。按照檢測試劑盒說明書進行檢測，并計算出各組細胞內(nèi)氧化指標活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）的含量、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）的活性及TAOC 水平，收集各組細胞上清液，按照各個試劑盒說明應用ELISA 法進行檢測并計算出各組細胞內(nèi)炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α的含量。

1.3 統(tǒng)計學方法

用SPSS 22.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 UVB對HaCaT細胞活力的影響

分別使用照射劑量為30 mj/cm2、60 mj/cm2、90 mj/cm2的UVB 對HaCaT 細胞進行照射后，隨著照射劑量增加，細胞的相對活力逐漸降低（P＜0.05），與空白組細胞比較，當照射劑量為30 mj/cm2時實驗組HaCaT 細胞的相對活力約為84%（P＜0.05），當UVB 照射劑量達到60 mj/cm2時實驗組HaCaT 細胞的相對活力約為53%（P＜0.05），當UVB照射劑量達到90 mj/cm2時實驗組HaCaT細胞的相對活力約為3%（P＜0.05），見圖1。因此，本實驗中選用照射劑量60 mj/cm2用于后續(xù)實驗建立光老化模型。

圖1 不同UVB照射劑量對細胞活力的影響

2.2 光老化相關因子檢測結果

2.2.1 UVB對HaCaT細胞中ROS含量的影響

空白組HaCaT細胞幾乎不產(chǎn)生ROS，經(jīng)過UVB輻射后，與空白組比較，模型組的光老化模型Ha-CaT 細胞中熒光增強（P＜0.05），見圖2、表1。說明經(jīng)UVB輻射后HaCaT細胞中ROS水平升高。

圖2 UVB對HaCaT細胞中ROS含量的影響（×100）

表1 UVB對HaCaT細胞中ROS含量的影響 ±s，n=3

表1 UVB對HaCaT細胞中ROS含量的影響 ±s，n=3

與空白組比較，*P＜0.05。

2.2.2 UVB對HaCaT細胞中氧化指標的影響

與空白組比較，模型組細胞中MDA含量升高，抗氧化酶SOD、CAT、GPx 活力降低，T-AOC 水平降低，見表2。

表2 UVB對HaCaT細胞中氧化指標的影響 ±s，n=3

表2 UVB對HaCaT細胞中氧化指標的影響 ±s，n=3

與空白組比較，*P＜0.05。

2.2.3 UVB對HaCaT細胞中炎癥因子的影響

與空白組比較，模型組細胞分泌的炎癥因子IL-1、IL-6及TNF-α均增多，見表3。

表3 UVB對HaCaT細胞中炎癥因子的影響pg/mL， ±s，n=3

表3 UVB對HaCaT細胞中炎癥因子的影響pg/mL， ±s，n=3

與空白組比較，*P＜0.05。

3 討論

長期紫外線照射，除導致皮膚干燥、粗糙、皺紋、色斑、缺乏彈性等光老化現(xiàn)象外，還可引起一系列皮膚疾患如毛細血管擴張、血管脆性增加、日光性角化癥甚至皮膚腫瘤等[4]。還與結締組織病如SLE 等相關。紫外線按照波長分類為長波紫外線（UVA），UVB和短波紫外線（UVC）。UVC波長短，穿透能力弱，在臭氧層已被吸收，極少到達地球表面；UVA穿透能力很強，可穿透臭氧層，到達地球表面的UV 大約有98%為UVA；UVB 穿透能力中等，能到達地球表面的只有約2%[5]。雖然到達地球表面的UVB只是太陽紫外線的一小部分，但急性暴露于高劑量的UVB會導致急性皮膚損傷如紅斑、水皰等曬傷樣病變；還可導致光毒反應、光變態(tài)反應；長期低劑量UVB 輻射則會導致DNA 損傷、尿苷酸光異構化等可致皮膚腫瘤發(fā)生[6]。UVB光損傷作用是同劑量UVA 的800～1 000 倍，可直接導致DNA 損傷，同時也可誘發(fā)氧化應激，是引起皮膚光老化的主要誘發(fā)因素[7]。因此，UVB 是造成皮膚光老化的主要紫外線，紫外線也是SLE等結締組織病的重要誘發(fā)因素。UVB主要作用于皮膚表皮及真皮淺層，角質形成細胞（HaCaT細胞）位于皮膚表皮，是構成表皮的重要細胞，也是UVB 作用的主要靶細胞[8]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，采用UVB作為構建光老化細胞模型的條件，使用不同輻射劑量的UVB 輻射細胞后，應用CCK-8 法檢測細胞的相對活力，結果顯示，隨著輻射劑量的增加，細胞的相對活力逐漸減弱。已有文獻報道，當較低劑量的紫外線輻射時，細胞可啟動自身抗氧化功能應對外界損傷，當輻射劑量過大超過細胞自身修復功能，就會氧化應激反應的發(fā)生。本實驗中，當輻射劑量達到30 mj/cm2時實驗組HaCaT 細胞的相對活力仍較高，超過80%，對細胞的損傷較輕；當輻射劑量為90 mj/cm2時實驗組Ha-CaT細胞的相對活力卻達到較低水平；當UVB照射劑量達到60 mj/cm2時HaCaT細胞最接近半致死率，為了更好的觀察接受輻射后細胞的損傷程度及修復能力，選用輻射后細胞相對活力接近50%的60 mj/cm2的作為后續(xù)實驗建立光老化模型的輻射劑量。

氧化應激是在外界因素刺激后，機體內(nèi)氧化作用與抗氧化作用平衡被打破，從而產(chǎn)生大量具有高度活性的活性氧自由基（ROS）引起機體氧化損害的一種反應。ROS 包括超氧陰離子（·O2-）、過氧化氫（H2O2）、羥自由基（·OH）等，參與了脂質、蛋白的氧化及DNA 損傷，當出現(xiàn)過量ROS 時細胞自身會啟動非酶和酶內(nèi)源性防御系統(tǒng)對抗氧化反應，其中抗氧化酶如SOD、CAT、GPx 等均可調節(jié)細胞內(nèi)ROS的水平[9]。SOD 可將·O2-轉化為H2O2和O2，CAT 則分解H2O2為H2O和O2，GPx利用GSH作為供氫體將H2O2和過氧化物還原為H2O和O2[8]。當細胞自身的抗氧化劑不足以清除產(chǎn)生的ROS 時，便發(fā)生氧化應激，進而引起組織氧化損傷。研究證明，高水平的ROS可導致細胞凋亡或壞死，低水平的ROS可改變細胞內(nèi)生長因子和原癌基因的表達[10]。細胞內(nèi)過量的ROS可引起DNA損傷、線粒體損傷、蛋白質氧化和能量代謝紊亂等，進一步導致細胞生長周期受阻、細胞衰老及凋亡[11]。同時，過量的ROS 還可直接作用于細胞膜，誘發(fā)細胞膜的脂質過氧化，丙二醛（MDA）作為脂質氧化終產(chǎn)物還可與蛋白質氨基酸反應導致蛋白質分解[12]。在本研究結果顯示，經(jīng)過UVB 輻射后，光老化模型HaCaT 細胞中ROS水平升高，MDA含量明顯升高，抗氧化酶CAT、SOD、GPx等酶活力降低，總抗氧化能力明顯降低，說明細胞的凋亡與UVB 輻射后HaCaT 細胞內(nèi)發(fā)生氧化應激反應有關。

UVB輻射不僅直接產(chǎn)生ROS損傷細胞，而且可激活IL-1β、IL-6、及TNF-α 等促進炎癥細胞因子表達，同時抑制抗炎癥細胞因子的表達，使細胞因子調控網(wǎng)絡失衡，從而引起細胞炎癥反應[13]。這些細胞因子還能誘導MMPs 的表達，導致細胞外基質降解、抑制膠原合成，進而加速光老化的過程[14]。TNF-α 是較早發(fā)現(xiàn)的炎癥細胞因子，除自身能引起炎癥反應外，還可通過其他細胞及組織代謝促進IL-1、IL-6 等其他炎癥因子的分泌。IL-6 通過自分泌機制誘導MMP-1 的表達，導致細胞外基質的降解，誘導皮膚光老化[15]。IL-1、IL-6 還可通過激活細胞表面受體AP-1 和核因子kB（Nuclear factor-k B，NFκB），促進其他炎癥因子的釋放、誘導多種MMPs產(chǎn)生，從而放大紫外線反應，誘導細胞凋亡，加速細胞外基質的降解[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過UVB 輻射后，光老化模型HaCaT 細胞中的炎癥因子IL-1、IL-6 和TNF-α含量均升高，提示UVB輻射可導致HaCaT細胞中炎癥因子的含量升高，從而進一步加重細胞的光老化表現(xiàn)，說明UVB 輻射HaCaT 細胞能很好復制出光老化現(xiàn)象。

綜上所述，HaCaT細胞經(jīng)UVB輻射后能引發(fā)光老化進程，且細胞的光老化與UVB輻射后細胞內(nèi)的氧化反應、炎癥反應有關，可為光老化細胞模型的構建提供依據(jù)，為抗光老化研究奠定基礎。