不同品系小鼠哮喘模型的建立與比較*

章謙男，肖 歡，李勞冬，孫起翔，徐思月，李超乾△

（廣西醫科大學第一附屬醫院 1.急診科；2.呼吸內科，南寧 530021）

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是一種慢性非特異性氣道疾病，氣道炎癥、氣道黏液高分泌、氣道高反應性及氣道重塑是其特征性表現[1]。隨著氣候與環境的惡化，其發病率逐年升高，目前已成為嚴重危害人類生命健康的危險因素[2]。鑒于人體試驗的局限性，目前主要通過哮喘動物模型來進行哮喘相關的研究。理想的動物模型要盡可能體現人類哮喘的病理生理機制，包括變態反應性炎癥、Th1/Th2細胞比例失衡、嗜酸性粒細胞增多、氣道分泌大量黏液等[3]。BALB/c 和C57BL/6 小鼠作為常用的哮喘模型實驗動物，主要有以下特征：遺傳背景明確、品系多、價格便宜且易誘發哮喘特征性癥狀[4]。本研究旨在建立并比較BALB/c和C57BL/6小鼠哮喘模型的差異，為哮喘相關研究提供方法學參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級BALB/c雄性小鼠和C57BL/6雄性小鼠各12只，5～6周齡，體重18～20 g，購自長沙天勤生物技術有限公司[SCXK（湘）2019-0014]。本次實驗使用廣西醫科大學實驗動物中心屏障動物實驗設施，經廣西醫科大學動物實驗倫理委員會批準（IACUC-202006004），并嚴格遵循3R原則。

1.2 主要試劑與儀器 雞卵清蛋白（OVA，美國Sigma公司）；氫氧化鋁佐劑（大連Meilunbio公司）；NOD樣受體蛋白3（NLRP3）抗體（北京Bioss公司）；caspase1 抗體（英國Abcam 公司）；凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）、GAPDH抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；白介素（IL）-4、干擾素（IFN）-γ 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（武漢Cusabio 公司）。MK3 型全波長酶標儀購自美國Thermo 公司；CX41-32 型正置熒光顯微鏡購自日本Olympus 公司；CN-100型醫用壓縮霧化器購自廣東粵華器械廠有限公司。

1.3 分組與造模 12只BALB/c小鼠和12只C57BL/6小鼠隨機分為對照組和哮喘組，每組6 只。哮喘組分別于0 d、7 d、14 d 腹腔注射含25 μg Ⅴ級OVA 和1 mg 氫氧化鋁佐劑的PBS 混懸液0.2 mL，自21 d起，每天霧化吸入20 mL 的OVA（20 g/L）30 min，連續7 d，激發小鼠哮喘。對照組給予等量的無菌PBS。

1.4 哮喘癥狀評分[5-6]27 d 時觀察經OVA 激發哮喘后20 min內小鼠上呼吸道癥狀（打噴嚏和頭面部搔抓動作）及哮喘癥狀并進行評分。上呼吸癥狀評分標準：（1）0分：無噴嚏或搔抓；（2）5分：1～3次噴嚏或搔抓；（3）10 分：4～6 次搔抓；（4）15 分：7 次及以上。哮喘癥狀評分標準：（1）0 分：無癥狀；（2）3 分：有輕微喘息；（3）6分：出現深快呼吸、躁動或靜伏等癥狀；（4）9 分：表現出明顯的腹式呼吸等特征性的哮喘癥狀。

1.5 血清IL-4 和IFN-γ 含量測定 眼球內眥取血，4 ℃下離心，取上清，采用ELISA法測定血清IL-4和IFN-γ含量。

1.6 支氣管肺泡灌洗液（BALF）細胞涂片及分類計數 用0.5 mL 4 ℃無菌PBS 輕柔灌洗肺臟3 次，收集BALF。回收的BALF 在4 ℃條件下以1 000 r/min 離心10 min，分離沉淀和上清。用1 mL PBS 重懸沉淀，細胞計數板統計每毫升的細胞總數；剩余沉淀涂片行瑞氏染色，在光學顯微鏡下計數200 個細胞以確定細胞分類。

1.7 肺組織病理學觀察 取小鼠左肺，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，制備肺組織石蠟切片，分別行蘇木精—伊紅（HE）染色和過碘酸雪夫（PAS）染色。觀察氣道周圍炎癥細胞浸潤與杯狀細胞分布，并進行病理學評分[7-8]。炎癥評分標準：無炎性細胞浸潤為0分，氣管周圍炎性細胞層＜1個、≥1個、2～4個、＞4個分別為1分、2分、3分、4分。氣道杯狀細胞占比評分，0 分：無杯狀細胞；1 分：＜25%杯狀細胞；2分：25%～50%杯狀細胞；3分：50%～70%杯狀細胞；4分：＞75%杯狀細胞。

1.8 免疫組化法檢測肺組織炎性小體表達 取肺組織石蠟切片，脫蠟、水化后用檸檬酸鹽高壓抗原修復，10%山羊血清封閉非特異性抗原；加入兔抗NLRP3（1∶200）、caspase1（1∶250）、ASC（1∶200）4 ℃下孵育過夜，加入二抗（1∶100）室溫孵育2 h；DAB顯色，蘇木精復染，1%鹽酸酒精分化后脫水、封片。光學顯微鏡下觀察，按染色程度評估肺組織炎性小體表達：無著色為陰性，淡黃色為弱陽性，淺褐色為陽性，深褐色為強陽性。

1.9 Western blotting 法檢測肺組織炎癥小體的表達情況 取小鼠肺組織，加入裂解液于冰上充分裂解，離心，取上清，BCA法檢測蛋白濃度；SDS-PAGE分離蛋白，將分離的蛋白轉至硝酸纖維素膜上；室溫封閉30 min，洗膜，加入一抗NLRP3（1∶1 000）、caspase1（1∶1 500）和ASC（1∶1 500）4 ℃孵育過夜；洗膜，加入熒光二抗（1∶1 000）室溫孵育1.5 h，洗膜，用LI-COR Odyssey system掃膜。應用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白表達量。

1.10 統計學方法 使用SPSS 20.0 統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 哮喘急性發作癥狀 在激發過程中，BALB/c哮喘組和C57BL/6 哮喘組均出現打噴嚏及頭面部搔抓動作，進而哮喘癥狀逐漸加重。BALB/c 哮喘組小鼠出現呼吸減慢、腹肌抽搐、點頭呼吸、行為遲滯和反應遲鈍等表現，而C57BL/6 哮喘組小鼠則表現得較為自如，偶可見自發活動減少與呼吸急促等表現。BALB/c 哮喘組與C57BL/6 哮喘組上呼吸道癥狀評分與哮喘癥狀評分均高于相應對照組（均P＜0.05），此外BALB/c 哮喘組相較于C57BL/6 哮喘組上呼吸道癥狀評分增高（P＜0.05），兩對照組間比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 不同品系小鼠哮喘癥狀表現 ±s，n=6

表1 不同品系小鼠哮喘癥狀表現 ±s，n=6

與BALB/c 對照組比較，*P＜0.05；與C57BL/6 對照組比較，#P＜0.05；與C57BL/6哮喘組比較，△P＜0.05。

2.2 各組BALF 中細胞總數和嗜酸性粒細胞數比較 與相應對照組比較，BALB/c哮喘組和C57BL/6哮喘組BALF中細胞總數和細胞質內嗜酸性粒細胞（粗大、整齊的磚紅色顆粒）增多，且BALB/c哮喘組多于C57BL/6哮喘組（均P＜0.01），見圖1。

圖1 各組BALF中細胞總數和嗜酸性粒細胞數比較

2.3 各組血清IL-4 和IFN-γ 含量比較 BALB/c 哮喘組血清中IL-4 濃度增高，IFN-γ 濃度降低，與BALB/c 對照組和C57BL/6 哮喘組比較，差異均有統計學意義（均P＜0.01）；而C57BL/6 哮喘組與C57BL/6 對照組血清IL-4 和IFN-γ 含量比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 各組血清IL-4和IFN-γ含量比較

2.4 肺組織病理學形態 HE染色顯示：BALB/c哮喘組氣道壁充血水腫，黏膜基底層增厚，管壁周圍及血管周圍有大量炎癥細胞浸潤，管腔狹窄，與BALB/c哮喘組比較，C57BL/6哮喘組病理學改變減輕。兩對照組氣道黏膜完整，無炎癥細胞浸潤（圖3A）。PAS染色顯示：BALB/c哮喘組支氣管周圍大量黏液分泌，杯狀細胞增生明顯，與BALB/c哮喘組比較，C57BL/6哮喘組氣道中僅少量杯狀細胞增生，而兩對照組幾乎未見黏液分泌及杯狀細胞增生（圖3B）。BALB/c 哮喘組與C57BL/6 哮喘組炎癥評分和氣道杯狀細胞占比評分均高于相應對照組（均P＜0.01），兩對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

圖3 小鼠肺組織HE染色和PAS染色結果（×200）

表2 氣道周圍炎癥評分及氣道杯狀細胞占比評分 ±s,n=6

表2 氣道周圍炎癥評分及氣道杯狀細胞占比評分 ±s,n=6

與BALB/c對照組比較，**P＜0.01；與C57BL/6對照組比較，##P＜0.01；與C57BL/6哮喘組比較，△△P＜0.01。

2.5 各組肺組織NLRP3、caspase 1 和ASC 蛋白表達比較 免疫組化結果顯示：BALB/c 哮喘組肺組織中NLRP3、caspase 1 及ASC 蛋白呈強陽性表達，主要見于氣道上皮細胞與炎癥細胞中，C57BL/6 哮喘組肺組織NLRP3、caspase 1 及ASC 蛋白表達較BALB/c 哮喘組減弱，兩對照組中上述蛋白主要呈弱陽性或不表達，見圖4。

圖4 免疫組化檢測炎癥小體相關蛋白表達（×400）

Western blotting結果顯示：與相應對照組比較，BALB/c 哮喘組與C57BL/6 哮哮喘組肺組織NLRP3、caspase 1 和ASC 蛋白表達量升高（均P＜0.01）；與BALB/c哮喘組比較，C57BL/6哮喘組中炎癥小體相關蛋白表達量降低（P＜0.01），兩對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05），見圖5。

圖5 各組肺組織炎癥小體相關蛋白表達量比較

3 討論

哮喘是一種由過敏原引起的慢性非特異性呼吸道疾病，其中氣道慢性炎癥是其本質特征[9]。嗜酸性粒細胞在哮喘炎癥反應的啟動和傳播中起著至關重要的作用[10]，Santus 等[11]研究表明，外周嗜酸性粒細胞數量增加的哮喘患者病情更為嚴重。本研究發現，BALB/c 哮喘組相較C57BL/6 哮喘組BALF 中炎癥細胞總數與嗜酸性粒細胞數量增多，且在激發時表現出呼吸減慢、點頭呼吸、腹肌抽搐等嚴重的哮喘癥狀，這與Morokata 等[12]的研究結果相似。以上結果表明在同樣條件下，BALB/c 小鼠可能更易誘發出嚴重的哮喘病情。Th1/Th2失衡在哮喘的發病過程中發揮著重要作用[13]，輔助型T2細胞（Th2）分泌的IL-4可促進B淋巴細胞分泌抗原特異性IgE 并可促進嗜酸性粒細胞的產生與聚集，進而影響哮喘慢性氣道炎癥反應[14]。輔助性T1 細胞（Th1）所分泌的IFN-γ 可抑制IL-4 的生成、IgE 合成及嗜酸性粒細胞的浸潤[15]。本研究中，與BALB/c對照組比較，BALB/c 哮喘組血清IL-4 含量增多，IFN-γ 含量減少；而C57BL/6 哮喘組與其對照組比較差異無統計學。通過對兩品系哮喘組進行比較，發現BALB/c 哮喘組能夠優勢性地反應出Th1/Th2失衡。表明在同樣的造模條件下BALB/c小鼠更易表現出哮喘特征性的Th2炎癥反應[16]。肺組織病理形態學變化是評價哮喘造模成功的重要指標之一，本研究病理學結果顯示，與C57BL/6 哮喘組比較，BALB/c 哮喘組氣道管腔狹窄，周圍炎癥細胞浸潤明顯，杯狀細胞增生并分泌大量黏液，提示BALB/c哮喘組肺組織病理學改變顯著，與既往研究結果[17]相似。結合其特異性的哮喘癥狀、大量嗜酸性粒細胞浸潤、Th1/Th2失衡及肺部病理損傷等情況，本組可以看到BALB/c小鼠經OVA致敏激發后對于哮喘表現得更為易感，兩品系間的哮喘表現具有差異性。

NLRP3炎癥小體由NLRP3、ASC和caspase1組成，其激活后可促進炎癥細胞因子的釋放，從而誘發各類炎癥反應[18]。相關研究顯示，通過干預機體NLRP3 炎性小體的激活，可抑制Th2 炎癥反應、減輕哮喘的氣道高反應性、氣道重塑和肺部炎性反應[19-20]。越來越多的證據表明NLRP3激活與哮喘發病機制密切相關[21]。本研究發現，兩哮喘組NLRP3、ASC、caspase1 蛋白表達均上調，且BALB/c 哮喘組與C57BL/6 哮喘組比較有差異。NLRP3 炎癥小體是誘導哮喘小鼠肺部Th2型過敏反應的關鍵因素[22]。結合BALB/c 哮喘組血清中高水平IL-4 和低水平IFN-γ 所誘導的哮喘特異性Th2 炎癥反應，在相同造模條件下，本組猜測造成兩品系間病理表現及氣道炎癥等造模結果差異可能與異常激活的NLRP3炎癥小體有關。然而，NLRP3炎癥小體在兩品系哮喘模型間的具體作用機制還需繼續深入研究。

綜上所述，本研究在同等條件下誘導的兩品系小鼠哮喘模型均獲成功，但綜合比較之下BALB/c哮喘組肺組織病理改變、嗜酸粒細胞浸潤及血清IL-4水平改變均更為明顯，特別是NLRP3、ASC 和caspase 1 含量提高；兩品系哮喘模型間差異可能與異常激活的NLRP3炎癥小體有關，但具體機制仍有待進一步的研究。