PARP-1通過調(diào)節(jié)HMGB1乙酰化和核移位促進缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷*

詹智暉，駱元平，李堪董

（海南西部中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，儋州 571799）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是世界范圍內(nèi)的主要死亡原因之一。及時溶栓治療或直接經(jīng)皮冠狀動脈介入治療是AMI 的主要治療方法，能有效減輕AMI 損傷，縮小心肌梗死范圍[1]。然而，缺血心肌的血液恢復(fù)可能導(dǎo)致心肌缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷，從而導(dǎo)致患者心血管功能障礙的加重和進一步的細(xì)胞死亡[2]。到目前為止，臨床上還沒有有效的預(yù)防心肌I/R損傷的策略。因此，深入探究I/R損傷的分子機制對于開發(fā)新的治療心肌I/R損傷的策略具有重要意義。高遷移率族蛋白-1（high mobility group protein-1，HMGB1）是一種高度保守的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，廣泛存在于心臟組織中，與細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，與心臟和血管炎癥密切相關(guān)[3]。研究表明，HMGB1的生物活性依賴于它的亞細(xì)胞定位。HMGB1核定位序列位點的過度乙酰化可導(dǎo)致HMGB1 從細(xì)胞核釋放到細(xì)胞質(zhì)[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，在心力衰竭小鼠模型中，核HMGB-1 的表達減弱。心肌細(xì)胞核HMGB1可減輕血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的病理性心臟重構(gòu)，從而在心力衰竭中發(fā)揮保護作用[5]。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1（poly-ADP-ribose polymerase 1，PARP-1）參與許多生理過程，如染色質(zhì)解縮、DNA復(fù)制、DNA修復(fù)、基因表達、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡和基因轉(zhuǎn)錄[6]。已有研究顯示，過表達PARP-1 可誘導(dǎo)HMGB1 的核移位，促進HMGB1在細(xì)胞外的分泌，從而加重心肌細(xì)胞肥大[7]。目前，關(guān)于心肌I/R 損傷中，PARP-1 和HMGB1 間的關(guān)系尚不明確。本研究旨在探討PARP-1是否通過調(diào)節(jié)HMGB1 乙酰化和核移位在缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中發(fā)揮作用，為心肌I/R損傷提供新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑 大鼠心肌細(xì)胞H9c2購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。PARP抑制劑3-Aminobenzamide（3-AB）、HMGB1抗體（ab18256）、Beclin1抗體（ab207612）、LC3抗體（ab192890）和p62抗體（ab207305）購自英國Abcam公司；CCK-8試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；EdU檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Annexin V FITC/PI 凋亡檢測試劑盒北京索萊寶科技有限公司；蛋白A+G 瓊脂糖珠、PARP-1 抗體（sc-74470）購自美國Santa Cruz 生物技術(shù)公司；Acetylated-lysine抗體（A2391）購自美國Abclonal 公司；細(xì)胞核蛋白提取試劑盒購自美國Thermo scientific；GAPDH 抗體購自北京義翹神州科技股份有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與H/R 模型建立 H9c2 細(xì)胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達到80%～90%時，胰酶消化細(xì)胞，進行傳代培養(yǎng)。建立H9c2細(xì)胞H/R模型[8]：棄去H9c2 細(xì)胞中的舊培養(yǎng)基，加入缺氧缺糖溶液（139 mmol/L NaCl、4.7 mmol/L KCl、0.5 mmol/L MgCl2、1.0 mmol/L CaCl2、5 mmol/L HEPES，pH=7.4），將細(xì)胞置于95%N2、5%CO2條件下培養(yǎng)5 h；將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，正常培養(yǎng)1 h。

1.3 實驗分組（1）取對數(shù)期生長的H9c2 細(xì)胞接種于96孔板，每孔1×104個細(xì)胞，將細(xì)胞分為0 mmol/L組、1.25 mmol/L 組、2.5 mmol/L 組、5 mmol/L 組、10 mmol/L 組和20 mmol/L 組，按照分組，向細(xì)胞中添加不同濃度3-AB。另設(shè)空白組，不予任何處理。（2）取對數(shù)期生長的H9c2 細(xì)胞接種于6 孔板，每孔1×106個細(xì)胞，將細(xì)胞分為對照組、H/R 組、3-AB 組（加入10 mmol/L 3-AB后進行H/R處理）、3-AB+oe-NC組（轉(zhuǎn)染oe-NC，加入10 mmol/L 3-AB后進行H/R處理）、3-AB+oe-HMGB1組（轉(zhuǎn)染oe-HMGB1，加入10 mmol/L 3-AB后進行H/R處理）。

1.4 CCK-8檢測細(xì)胞活力 取對數(shù)期生長的H9c2細(xì)胞接種于96孔板，每孔1×104個細(xì)胞。根據(jù)CCK-8 試劑盒說明書檢測各孔吸光度（OD）值。細(xì)胞活力（%）=（實驗組OD 值－空白組OD 值）/（對照組OD 值－空白組OD值）×100%。

1.5 EdU 實驗檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)期生長的H9c2細(xì)胞接種于96孔板，每孔1×104個細(xì)胞。向各組細(xì)胞中添加EdU工作液（終濃度為10 μmol/L），細(xì)胞于37 ℃條件下孵育2 h；棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定，PBS洗滌，添加0.3%Triton X-100處理15 min；去除反應(yīng)液，PBS 洗滌，Click反應(yīng)液室溫下避光孵育30 min，DAPI 室溫下孵育10 min；PBS 洗滌，熒光顯微鏡下觀察并拍照。EdU 陽性細(xì)胞數(shù)（%）=EdU陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集H9c2 細(xì)胞，預(yù)冷PBS 清洗細(xì)胞后重新收集細(xì)胞。向細(xì)胞中加入1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，并將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個/mL。取100 μL細(xì)胞懸液，向細(xì)胞中添加5 μL FITC-Annexin V 和5 μL PI 工作液，充分混勻。細(xì)胞于室溫條件下避光孵育15 min。向細(xì)胞中加入400 μL 1×結(jié)合緩沖液，充分混勻后用流式細(xì)胞儀檢測。

1.7 免疫沉淀法檢測HMGB1 乙酰化 收集H9c2細(xì)胞，裂解液裂解細(xì)胞，收集上清液。細(xì)胞上清液用1 mg 正常兔IgG 和20 mL 蛋白A+G 瓊脂糖珠在4 ℃條件下孵育2 h。離心后，將上清液轉(zhuǎn)入新的離心管，隨后加入40 mL 蛋白A+G 瓊脂糖珠和HMGB1抗體，置于4 ℃條件下孵育過夜。離心后收集瓊脂糖珠，用PBS 洗滌3 次后，Western blotting 法檢測HMGB1和Acetylated-lysine蛋白表達。

1.8 免疫熒光染色檢測細(xì)胞中HMGB1的表達 棄去H9c2 細(xì)胞的培養(yǎng)基，4%多聚甲醛室溫條件下固定細(xì)胞15 min。PBS 清洗細(xì)胞，添加0.3%Triton X-100處理細(xì)胞15 min。5%牛血清白蛋白封閉液室溫條件下封閉30 min。棄去封閉液，添加HMGB1 抗體稀釋液（1∶200），4 ℃條件下孵育過夜。添加特異性熒光二抗（1∶5 000），室溫條件下避光孵育1 h。加入DAPI 室溫條件下孵育10 min。PBS清洗細(xì)胞后，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.9 Western blotting法檢測細(xì)胞PARP-1、HMGB1、Beclin1、LC3、p62和Acetylated-lysine蛋白表達 收集H9c2細(xì)胞，參照細(xì)胞核蛋白提取試劑盒說明書所示，分離胞質(zhì)蛋白和胞核蛋白。操作步驟如下：收集1×106個細(xì)胞，加入200 μL CER1溶液，渦旋后，冰上共孵育10 min，離心收集上清為細(xì)胞質(zhì)蛋白；在沉淀中加入11 μL CER2 和100 μL NER 溶液，渦旋后冰上共孵育40 min，離心收集上清為細(xì)胞核蛋白。另外，收集H9c2 細(xì)胞，裂解液裂解細(xì)胞。收集上清液并測定其蛋白濃度。各組取30 μg蛋白進行SDSPAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉3 h；加入一抗PARP-1（1∶2 000）、HMGB1（1∶1 000）、Beclin1（1∶1 000）、LC3（1∶1 000）、p62（1∶1 000）、Acetylated-lysine（1∶1 000）和GAPDH（1∶5 000）4 ℃下孵育過夜，加入二抗（1∶5 000）室溫下孵育1 h，滴加ECL發(fā)光液，凝膠成像系統(tǒng)掃描。Image J軟件分析各蛋白條帶的灰度值。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H/R 對心肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與對照組比較，H/R組H9c2細(xì)胞活力和EdU陽性細(xì)胞數(shù)降低（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05），見圖1。

圖1 H/R對心肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.2 H/R 對心肌細(xì)胞中Beclin 1、PARP-1、HMGB1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達的影響 與對照組比較，H/R 組H9c2 細(xì)胞中Beclin 1、PARP-1、HMGB1 蛋白表達和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高（P＜0.05），p62 蛋白表達降低（P＜0.05），見圖2。

圖2 H/R對各組心肌細(xì)胞中Beclin 1、PARP-1、HMGB1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達比較

2.3 PARP-1特異性抑制劑3-AB對HMGB1蛋白表達及乙酰化水平的影響 使用不同濃度3-AB 處理細(xì)胞，結(jié)果顯示：與0 mmol/L 組比較，20 mmol/L 組細(xì)胞活力降低（P＜0.05），而1.25 mmol/L、2.5 mmol/L、5 mmol/L 和10 mmol/L 組細(xì)胞活力比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖3A。因此選擇10 mmol/L 3-AB進行后續(xù)實驗。

與對照組比較，H/R組PARP-1、HMGB1蛋白表達及HMGB1 乙酰化水平升高（P＜0.05）；與H/R 組比較，3-AB組PARP-1、HMGB1蛋白表達及HMGB1乙酰化水平降低（P＜0.05）；與3-AB+oe-NC組比較，3-AB+oe-HMGB1 組HMGB1 蛋白表達及HMGB1乙酰化水平升高（P＜0.05），而兩組PARP-1 蛋白表達比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；3-AB+oe-NC組與3-AB組各指標(biāo)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見圖3B～3E。

圖3 PARP-1特異性抑制劑3-AB對HMGB1蛋白表達及乙酰化水平的影響

2.4 PARP-1特異性抑制劑3-AB對HMGB1核轉(zhuǎn)移的影響 與對照組比較，H/R 組胞核中HMGB1 蛋白表達降低，胞質(zhì)中HMGB1 蛋白表達升高（均P＜0.05）；與H/R 組比較，3-AB 組胞核中HMGB1 蛋白表達升高，胞質(zhì)中HMGB1 蛋白表達降低（均P＜0.05）；與3-AB+oe-NC組比較，3-AB+oe-HMGB1組H9c2 細(xì)胞胞核中HMGB1 蛋白表達降低，胞質(zhì)中HMGB1 蛋白表達升高（均P＜0.05）；3-AB+oe-NC組與3-AB組胞核和胞質(zhì)中HMGB1蛋白表達比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見圖4。

圖4 PARP-1特異性抑制劑3-AB對HMGB1核轉(zhuǎn)移的影響

2.5 PARP-1/HMGB1 軸對H/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與對照組比較，H/R組H9c2細(xì)胞活力和EdU 陽性細(xì)胞數(shù)降低，細(xì)胞凋亡率升高（均P＜0.05）；與H/R組比較，3-AB 組H9c2細(xì)胞活力和EdU 陽性細(xì)胞數(shù)升高，細(xì)胞凋亡率降低（均P＜0.05）；與3-AB+oe-NC組比較，3-AB+oe-HMGB1組H9c2細(xì)胞活力和EdU陽性細(xì)胞數(shù)降低，細(xì)胞凋亡率升高（均P＜0.05）；3-AB+oe-NC組與3-AB組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見圖5。

圖5 PARP-1/HMGB1軸對H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.6 PARP-1/HMGB1 軸對H/R 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬的影響 與對照組比較，H/R組Beclin1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達升高，p62蛋白表達降低（均P＜0.05）；與H/R 組比較，3-AB 組Beclin1 和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達降低，p62 蛋白表達升高（均P＜0.05）；與3-AB+oe-NC 組比較，3-AB+oe-HMGB1 組Beclin1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達升高，p62 蛋白表達降低（均P＜0.05）；3-AB+oe-NC 組與3-AB 組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見圖6。

圖6 PARP-1/HMGB1軸對H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬的影響

3 討論

心肌I/R損傷是缺血心肌血流量恢復(fù)過程中最重要的并發(fā)癥之一[9]。I/R損傷的機制是復(fù)雜的、多因素的，包括活性氧產(chǎn)生過多、細(xì)胞內(nèi)鈣失衡、線粒體功能障礙、過度炎癥和程序性細(xì)胞死亡等[10]。I/R損傷的潛在機制尚不完全清楚。因此，還需繼續(xù)深入探究心肌I/R 損傷的潛在機制，以開發(fā)有效的I/R損傷治療靶點。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的過程，在心肌I/R損傷中心肌細(xì)胞丟失、缺血后不利的心臟重構(gòu)方面都有重要作用[11]。因此，抑制心肌細(xì)胞過度凋亡是防治心肌I/R損傷的有效途徑。PARP-1參與調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡，抑制PARP-1 表達可抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的H9c2 細(xì) 胞凋亡[12]。Liu 等[13]研究表明，沉默PARP-1 可以預(yù)防缺氧誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞凋亡和自噬。本研究結(jié)果顯示，H/R處理可誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞活力和增殖能力降低，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外，H/R處理可導(dǎo)致H9c2 細(xì)胞中PARP-1 表達上調(diào)。該結(jié)果提示，PARP-1 可能在H9c2 細(xì)胞H/R 損傷中發(fā)揮重要作用。使用PARP 抑制劑3-AB 抑制H9c2 細(xì)胞中PARP-1表達后發(fā)現(xiàn)H/R處理的H9c2細(xì)胞活力和增殖能力升高，細(xì)胞凋亡率降低。該研究結(jié)果表明，靶向抑制PARP-1可抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

自噬是一個通過溶酶體降解途徑降解和消化成熟蛋白質(zhì)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的過程，以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和細(xì)胞器的循環(huán)[14]。在選擇性自噬中，靶標(biāo)由自噬受體（如p62）識別，自噬受體通過與LC3 和其他自噬相關(guān)蛋白（如Beclin1）相互作用啟動膜募集[15]。在某些條件下，自噬可以通過降解受損的線粒體，保護細(xì)胞免于凋亡或死亡。Bauvy等[16]發(fā)現(xiàn)，在硫化舒鱗酸對宮頸癌HT-29 細(xì)胞作用時，受損的線粒體自動進入自噬途徑，抑制了自身功能紊亂，隔離凋亡因子釋放，從而保護細(xì)胞免于凋亡。然而，當(dāng)外界刺激強度達到某一閾值時，自噬功能將進一步加強，導(dǎo)致細(xì)胞壞死[17]。目前，已有證據(jù)顯示，在心臟I/R 過程中，活性氧的產(chǎn)生增加導(dǎo)致Beclin-1 的強烈表達，從而促進細(xì)胞自噬并導(dǎo)致細(xì)胞死亡[17]。PARP-1激活的自噬損傷線粒體代謝，促進心肌細(xì)胞死亡。PARP-1 沉默或特異性抑制劑可抑制缺血心肌細(xì)胞凋亡和纖維化[18]。本研究結(jié)果顯示，H/R處理可誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞自噬，使用PARP抑制劑3-AB 抑制H9c2 細(xì)胞中PARP-1 表達后發(fā)現(xiàn)H/R處理的H9c2細(xì)胞自噬水平降低。該研究結(jié)果表明，靶向PARP-1可抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬。

由于缺乏信號肽，HMGB1 不能通過高爾基體/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)依賴的分泌途徑分泌。它從細(xì)胞核運輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)，然后進入溶酶體，最終通過胞吐作用釋放到細(xì)胞外空間[19]。乙酰化在主動分泌HMGB1中起重要作用。HMGB1中賴氨酸殘基的乙酰化是其轉(zhuǎn)位到細(xì)胞質(zhì)的先決條件[20]。AMI后的前2～3 d或在I/R 期間，存在持續(xù)性炎癥，此時HMGB1 以氧化的形式存在，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬，使心功能惡化[21]。Xue 等[22]研究也證明，HMGB1通過促進炎癥細(xì)胞因子的釋放，介導(dǎo)心肌I/R 損傷，促進細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，H/R處理可導(dǎo)致H9c2細(xì)胞中HMGB1 表達上調(diào)。此外，H/R 處理可誘導(dǎo)H9c2 細(xì)胞中HMGB1 乙酰化水平升高，促進胞核HMGB1移位至胞質(zhì)中。該研究結(jié)果提示，HMGB1 可能在H/R導(dǎo)致的H9c2細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要作用。目前，已有證據(jù)顯示，PARP-1可通過正向調(diào)節(jié)HMGB1乙酰化水平和胞漿轉(zhuǎn)移，促進阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[23]。本研究結(jié)果顯示，靶向抑制PARP-1表達可抑制H/R 處理的H9c2 細(xì)胞中HMGB1 乙酰化水平和胞核—胞漿轉(zhuǎn)移。而過表達HMGB1可部分逆轉(zhuǎn)抑制PARP-1 表達對H9c2 細(xì)胞H/R 損傷的影響，導(dǎo)致細(xì)胞活力和增殖能力降低，細(xì)胞凋亡率和自噬水平升高。該研究結(jié)果表明靶向抑制PARP-1通過抑制H9c2細(xì)胞中HMGB1乙酰化水平和核轉(zhuǎn)移，改善H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，H/R處理可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中PARP-1 和HMGB1 表達上調(diào)。靶向抑制PARP-1 通過阻礙H9c2 細(xì)胞中HMGB1 乙酰化和胞核—胞質(zhì)轉(zhuǎn)移，促進H/R 誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡和自噬。該研究結(jié)果為明確心肌I/R損傷的相關(guān)分子機制及開發(fā)新的治療靶點提供了新的科學(xué)資料。