氯胺酮通過p38 MAPK信號通路對乳腺癌細胞生物學行為的影響*

高素琴，高 靜，高彥東

（榆林市第一醫院麻醉科，榆林 719000）

乳腺癌是常見的惡性腫瘤之一，其發病率位于女性癌癥榜首，每年約有52.2 萬人死于乳腺癌[1-2]。近年來其發病率逐漸上升，嚴重影響女性的身心健康[3]。乳腺癌的發病機制復雜，是細胞內的DNA發生突變導致細胞惡性增殖的結果，也是細胞內多種信號共同作用的復雜過程[4]。p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinases,p38 MAPK）是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPK）通路中重要的組成部分，受到多種炎癥因子、激活因子等的調控，在細胞生長、凋亡等過程中具有重要作用[5-6]。研究顯示，激活后的p38 MAPK可以發生磷酸化，激活下游分子，調節細胞的基因轉錄和細胞生長，參與介導多種基因或因子的表達，從而影響腫瘤微環境[7]，有研究表明，p38 MAPK 可能是乳腺癌的潛在治療靶點[8]。氯胺酮（ketamine）是N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-Daspartate,NMDA）受體拮抗劑，具有見效快、輕度鎮靜、明顯鎮痛效果的麻醉藥物[9]。近年來，低劑量氯胺酮越來越多地用于治療中度至重度急性和慢性疼痛、抑郁癥等[10-11]。此外，氯胺酮還能夠抑制肺癌細胞的生長與轉移[12]。但是氯胺酮在乳腺癌治療方面研究甚少。本課題將研究氯胺酮是否通過p38 MAPK信號通路對乳腺癌細胞增殖、侵襲與遷移產生影響，進一步探討其作用機制，為臨床上治療乳腺癌提供新的理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料 乳腺癌細胞MDA-MB-231 細胞系購自上海癌癥研究所（中國）。RPMI-1640培養基（批號：21970076）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（批號：30044333）和TRIzol 試劑（批號：15596018）均購自美國Gibco公司。逆轉錄試劑盒（批號：A3500）購自promega 公司。TB GreenTMPremix Ex Taq II 試劑盒（批號：RR820）購自TaKaRa公司。氯胺酮（批號：YZ-1356020）和RIPA 裂解液（批號：R0010）購自北京索萊寶公司。基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）單克隆抗體（批號：ab37150）、基質金屬蛋白酶9（matrix MMP-metalloproteinase 9，MMP-9）多克隆抗體（批號：ab73734）、磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer solution，PBS）（批號：ab64026）購自英國Abcam 公司。p38 MAPK 抗體（批號：9212L）、p-p38 MAPK 抗體（批號：9215S）、GAPDH多克隆抗體（批號：2118L）、山羊抗兔IgG二抗（批號：7054S）、山羊抗鼠IgG 二抗（批號：5470S）購自美國 Cell Signaling Technology 公司。SB203580（p38 MAPK抑制劑）（批號：HY-10256）購自MCE 公 司。孔 徑8.0 μm 的Transwell 小 室 和PVDF膜購自Millipore公司。

1.2 細胞培養與分組 MDA-MB-231 細胞用含10%FBS 的RPMI-1640 培養基，置于37 ℃、5%CO2的培養箱中培養，2 d 換液1 次，以保證細胞所需的營養成分。將MDA-MB-231 細胞以1×105個/孔密度接種于24 孔板，可分為4 組：control 組（常規培養）、氯胺酮組（培養基中添加10 μg/mL氯胺酮處理24 h）、SB203580 組（培養基中添加20 μmol/L SB203580 處理2 h）、氯胺酮+SB203580 組（培養基中添加氯胺酮10 μg/mL 處理24 h+SB203580 20 μmol/L處理2 h）。

1.3 克隆形成實驗 培養24 h 后的各組細胞以1×103個/孔接種于6 cm 細胞培養皿中。10 d 后，用結晶紫染色溶液染色細胞，并計數含有≥50個細胞的集落，用奧林巴斯熒光倒置顯微鏡拍攝代表性集落并統計。實驗獨立重復3次。

1.4 Transwell 侵襲實驗 Transwell 小室放入24 孔培養板中，取對數生長期的MDA-MB-231細胞并計數，以每孔均含3×104個細胞，用移液槍在每個上室中添加100 μL的細胞懸液，平均分為4組，除control組，每個上室再加入100 μL含有不同濃度氯胺酮和SB203580 的培養基。在下室中加入600 μL 含10%FBS的培養基，每組均設6個復孔，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h。取出小室，棄去培養基，用PBS洗滌3次，于下室每孔加入600 μL 4%甲醛固定15 min，以棉簽擦去上室內未遷移的細胞，用1%結晶紫染色20 min，用PBS 洗滌2 次，于顯微鏡下隨機選取5 個視野（×200）觀察統計每孔細胞數并采集圖像，計數細胞數反映細胞的侵襲能力。實驗獨立重復3次。

1.5 細胞劃痕實驗 取對數生長期的MDA-MB-231細胞并計數，以2×104個/mL接種于12孔培養板中，待細胞生長90%融合時，用200 μL 移液槍槍頭于單層細胞上作劃痕，用PBS洗滌3次后，加入10%FBS 的RPMI-1640 培養基。再隨機將細胞分為4 組：control 組、氯胺酮組、SB203580 組和氯胺酮+SB203580組，各組的藥物干預同“1.2項”，每組均設3 個復孔，24 h 后在奧林巴斯熒光倒置顯微鏡下觀察細胞愈合程度并拍照，測量細胞間的劃痕距離。實驗獨立重復3次。

1.6 實時熒光定量PCR（RT-qPCR） 各組細胞培養24 h 后，棄去培養基，用PBS 洗滌兩次，加入TRIzol 試劑提取各組細胞總RNA，用Nanodrop 2000 儀器檢測樣品RNA濃度。然后按照反轉錄試劑盒說明書將總RNA 反轉錄成cDNA。按照RTqPCR試劑盒說明書配置相應的體系，每組設置3個復孔。使用TB GreenTMPremix Ex Taq Ⅱ試劑盒進行RT-qPCR。RT-qPCR的條件如下：95 ℃30 s（1循環），95 ℃5 s、60 ℃30 s（40 循環）。使用StepOne-Plus 儀器完成實驗后，采用2-△△CT法分析數據。實驗獨立重復3次。其中使用的引物見表1。

表1 引物序列

1.7 蛋白質印跡法（Western blotting） 培養24 h后的各組細胞用蛋白酶抑制劑裂解液裂解細胞后提取蛋白，用BCA法測定總蛋白含量。取等量蛋白質樣品上樣，SDS-PAGE分離蛋白質后轉膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，之后加入稀釋后的MMP-2（1∶1 000）、MMP-9（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）一抗，4 ℃冰箱搖床上孵育過夜。用TBST洗膜3次，每次10 mim，加入對應于一抗種屬來源的HRP標記的二抗（1:2 000），在室溫搖床上孵育1 h，用TBST洗膜3次，每次10 min。使用ECL 化學發光液顯色發光，凝膠成像系統拍照，Image Pro Plus圖像分析系統對蛋白條帶進行分析。

1.8 統計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，至少取3 次獨立實驗結果，以均數±標準差（±s）表示，多組間數據比較采用單向方差分析one-way ANOVA分析。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 氯胺酮通過p38 MAPK 信號通路對乳腺癌細胞中p-p38 表達的影響 與control 組相比，氯胺酮組和SB203580 組均能降低p38 MAPK 磷酸化水平（P＜0.05）；而與氯胺酮組或SB203580組相比，氯胺酮+SB203580組p38 MAPK磷酸化水平均降低（P＜0.001）（圖1）。

圖1 氯胺酮通過p38 MAPK信號通路對乳腺癌細胞中p-p38表達的影響

2.2 氯胺酮通過抑制p38 MAPK 信號通路對乳腺癌細胞增殖、侵襲與遷移的影響 與control 組相比，氯胺酮和SB203580 均能抑制MDA-MB-231 細胞增殖和侵襲能力（P＜0.001 或P＜0.05），而與氯胺酮組或SB203580 組相比，氯胺酮+SB203580 組MDA-MB-231細胞增殖和侵襲能力下降（P＜0.001）（圖2A和圖2B）。與control組相比，氯胺酮和SB203580組中MDA-MB-231 細胞遷移超出劃痕部分減少（P＜0.05），而與氯胺酮組或SB203580組相比，氯胺酮+SB203580 組劃痕距離均寬于其單獨使用（圖2C）。

圖2 氯胺酮通過抑制p38 MAPK信號通路對乳腺癌細胞增殖、侵襲與遷移的影響

2.3 氯胺酮通過抑制p38 MAPK 信號通路對乳腺癌細胞中MMP-2和MMP-9表達的影響 氯胺酮和SB203580 能抑制MDA-MB-231 細胞中MMP-2 和MMP-9 mRNA 和蛋白的表達（P＜0.05），氯胺酮與SB203580聯合使用后，MDA-MB-231細胞中MMP-2 和MMP-9 mRNA 和蛋白的表達降低（P＜0.001）（圖3）。

圖3 氯胺酮通過抑制p38 MAPK信號通路對乳腺癌細胞中MMP-2和MMP-9表達的影響

3 討論

乳腺癌是常見于女性的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率較高，對女性的健康和生命威脅最大，轉移和復發是其最主要的死亡原因[13]。隨著早期篩查和診斷技術的不斷完善，手術切除原發腫瘤是有可能治愈乳腺癌的最主要的治療手段。因此，尋找預防及治療乳腺癌的方法或靶點成為當今醫學界急需攻克的難題之一。

氯胺酮是NMDA受體拮抗劑，在臨床麻醉與鎮痛領域受到廣泛應用。目前，有關麻醉藥物對惡性腫瘤侵襲和遷移能力的影響越來越受到臨床的關注。陳小紅等[12]研究發現，氯胺酮能夠抑制肺癌A549細胞的侵襲和遷移能力，同時能明顯抑制NFkB P65 蛋白水平的表達，以上研究顯示，氯胺酮有抑制惡性腫瘤生長和轉移的作用。因此，氯胺酮可能在惡性腫瘤的發生發展中發揮著重要作用。本研究發現氯胺酮能有效抑制MDA-MB-231 細胞增殖、侵襲和遷移能力（P＜0.05），說明氯胺酮可能有效抑制乳腺癌細胞的發生和發展。

MAPK 信號通路是介導細胞反應的重要信號轉導系統，其中P38 MAPK信號通路參與細胞增殖、凋亡、周期及分化等的調控，在乳腺癌等腫瘤中呈現持續激活表達[14]。抑制P38 轉導通路信號的活性，能夠抑制乳腺癌的浸潤和轉移[15]。在本實驗中，通過檢測磷酸化水平、細胞克隆形成實驗和Transwell 侵襲實驗，發現相比于control 組，氯胺酮組和SB203580組均能降低p38 MAPK磷酸化水平，抑制MDA-MB-231細胞增殖和侵襲能力，而與氯胺酮組或SB203580 組相比，氯胺酮+SB203580 組p38 MAPK磷酸化水平均降低，MDA-MB-231細胞增殖和侵襲能力下降，說明氯胺酮能夠抑制p38 MARK的磷酸化，且能抑制乳腺癌的增殖能力。同時通過細胞劃痕試驗結果表明，相比于control 組，氯胺酮組和SB203580組MDA-MB-231細胞遷移超出劃痕部分減少，而氯胺酮與SB203580 聯合使用時劃痕距離寬于其單獨使用。

基質金屬蛋白酶（MMPs）是一類活性依賴于Ca2+、Zn2+等金屬離子的蛋白水解酶，參與細胞外基質的降解。大量的研究表明，癌細胞產生的MMP-2和MMP-9可以降解細胞外基質成分，并且在腫瘤侵襲中具有至關重要的作用[16-17]。李培生等[18]研究發現，異丙酚能夠抑制肝癌細胞的侵襲能力，同時能明顯降低MMP-2和MMP-9的表達水平。本實驗還進一步研究了基質金屬蛋白在各組細胞中的表達情況，結果發現氯胺酮和SB203580均能抑制MDAMB-231 細胞中MMP-2 和MMP-9 mRNA 和蛋白的表達，氯胺酮與SB203580 聯合使用后，MDA-MB-231細胞中MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白的表達降低，因此氯胺酮能明顯降低基質金屬蛋白的表達。由此推斷，氯胺酮通過抑制p38 MAPK 信號通路抑制MDA-MB-231細胞的增殖、侵襲與遷移。

綜上所述，氯胺酮可通過p38 MAPK 信號通路抑制乳腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移，達到治療或緩解乳腺癌病癥的目的。因此，氯胺酮在乳腺癌的治療和預后等方面帶來新的應用。