基于SOCS1/JAK-STAT3通路探究雷公藤紅素治療特應性皮炎小鼠的作用機制*

段 垚，朱立宏△，董延萍

（1.湖北省武漢市中醫醫院皮膚科，武漢 430000；2.江西省九江市第一人民醫院健康管理中心，九江 332000）

特應性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一種常見的慢性復發性炎癥性皮膚病。復發性濕疹、瘙癢及皮膚干燥是AD 的主要癥狀[1]。AD 好發于兒童，且發病機制復雜、復發性高、病程較長，嚴重影響患者生活質量[2]。目前研究發現，變應原刺激機體T 淋巴細胞活化，介導的免疫炎癥反應激活，是導致皮膚炎癥損傷的關鍵機制[3]。雷公藤紅素（Tripterine）具有顯著的抗炎及調節免疫作用[4]，已有研究發現，其可體外抑制AD 小鼠T 淋巴細胞活化，預示雷公藤紅素可能為治療AD小鼠皮膚炎癥損傷的潛在藥物[5]。細胞因子信號轉導抑制因子1（suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1）可通過負性調節Janus激酶（janus kinase，JAK）/信號轉導子和轉錄激活物3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）來有效避免機體產生過度的免疫反應，阻止慢性炎癥性疾病的發展進程[6]。因此，本研究建立小鼠AD 模型，從SOCS1/JAK-STAT3 通路方面，探究驗證雷公藤紅素對AD 的治療作用，并初步探究其治療機制，以期尋找治療AD的特異性有效藥物。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60 只健康C57BL/6 小鼠，雄性，清潔級，體重18～22 g，購自安徽省盛鵬實驗動物科技有限公司，批號：SCXK（皖）2020-002。本實驗經本院動物倫理委員會批準同意，批號為IACUC-01（201900312）。

1.2 試劑

雷公藤紅素（上海源葉生物科技有限公司，貨號：B20707，規格：20 mg）；白細胞介素-4（IL-4）ELISA 試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司，貨號：SBJ-M0064）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒（上海名勁生物科技有限公司，貨號：C11097）、免疫球蛋白E（IgE）ELISA試劑盒（上海名勁生物科技有限公司，貨號：C10209）；HE 試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，貨號：AR1180）；SOCS1（貨號：ab280886）、T 淋巴細胞表面標志CD3（貨號：ab5690）、JAK1（貨 號：ab125051）、STAT3（貨號：ab68153）、磷酸JAK1（p-JAK1）（貨號：ab1380056）、IL-17（貨號：ab79056）、RORγt（貨號：ab207082）、IL-23（貨號：ab189300）、IL-6（貨號：ab259341）等兔抗小鼠抗體均購自美國abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 模型制備及分組 參照文獻[7]方法，經小鼠耳背部分別涂抹20 μL濃度為2 nmol/L的卡泊三醇（MC903）溶液（溶劑為無水乙醇），連續10 d，建立AD模型，若小鼠耳部皮膚有抓痕、糜爛、紅斑出血、結痂鱗屑等現象視為造模成功（共50只），按隨機數字表法將造模成功小鼠隨機分為模型組、雷公藤紅素組、SOCS1 基因低表達（si-SOCS1）組、雷公藤紅素+si-SOCS1（聯合）組、si-SOCS1陰性對照（si-NC）組，每組10 只。另取10 正常C57BL/6 小鼠作為正常對照組。雷公藤紅素組參照文獻[8]灌胃給20 mg/kg的雷公藤紅素溶液（生理鹽水溶解成2 mg/mL 的溶液，按10 mL/kg的劑量灌胃給藥），1次/d，連續14 d；si-SOCS1 及si-NC 組分別經尾靜脈注射含SOCS1基因低表達序列的腺病毒載體溶液及其SOCS1 陰性對照序列的腺病毒載體溶液（50 mmoL/L），各20 μL，2 次/d；聯合組灌胃給予雷公藤紅素的同時，經尾靜脈注射含SOCS1 基因低表達序列的腺病毒載體溶液；模型組及正常對照組灌胃給予10 mL/kg的生理鹽水溶液。末次給藥結束后，觀察小鼠行為，并進行后續實驗。

1.3.2 小鼠搔抓行為評價 各組小鼠在籠子里適應15 min 后，記錄10 min 內小鼠抓鼻、耳和背側皮膚行為的次數。

1.3.3 小鼠皮炎評分 各組小鼠，做完搔抓次數檢測后，參照文獻[9]中評分標準對雙側耳部組織紅斑、出血、水腫、糜爛、剝脫、干燥等AD 皮損癥狀的嚴重程度進行皮炎評分，最高分以9分為計，評分越高預示其AD皮炎癥狀越嚴重。

1.3.4 ELISA法檢測血清IL-4、TNF-α、IgE水平

取小鼠腹主動脈血3 mL，按ELISA試劑盒說明書方法檢測血清IL-4、TNF-α、IgE水平。

1.3.5 小鼠耳部皮膚病理損傷觀察 將小鼠斷頭處死，剪取雙側耳部組織，一側置于-80 ℃保存備用，另一側于4%多聚甲醛中固定24 h后，浸蠟包埋制成5 μm 切片，取部分切片按HE 染色液說明書方法，染色后隨機取5個視野于光鏡下觀察拍照。

1.3.6 免疫組化法檢測SOCS1 及T 淋巴細胞表面標志CD3陽性表達 取剩余耳部皮膚石蠟切片，脫蠟及抗原修復處理后，滴加1∶200的SOCS1、CD3兔抗鼠抗體，4 ℃孵育24 h 后，滴加生物素標記的IgG抗體室溫孵育2 h后，DAB及蘇木精復染后，于光鏡下觀察拍照，Image-Pro Plus 6.0 軟件分析每視野下陽性染色的平均光密度值。

1.3.7 RT-qPCR法檢測SOCS1及上游靶基因-miR-155表達 取冰凍耳部組織，4 ℃解凍，取約0.5 g剪碎、勻漿，RNAiso Plus 試劑盒提取總RAN，逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA，PCR 試劑盒結合PCR 儀行RT-PCR反應，反應體系：95 ℃預變性8 min，熱啟動行45 個（95 ℃變性35 s，50 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s），miR-155 上游引物：5’-CGCGTTAATGCTAATTGTGATG-3’，下游引物：5’-TGCAGGGTCCGAGGT-3’，以U6 為內參；SOCS1 上游引物5’-CCAGGTGGCAGCCGACAA-3’，下游引物：5’-TGCGCCGGTAATCGGAGT-3’，以GADPH 為 內 參，2-△△Ct法計算基因相對表達水平，引物序列由上海生工生物工程公司設計合成。

1.3.8 Western blotting 檢 測SOCS1/JAK-STAT3 通路及下游炎癥相關蛋白表達 取冰凍耳部組織，4 ℃解凍，取約0.5 g 剪碎、勻漿，提取蛋白，BCA 法測蛋白濃度，取80 μg 蛋白行電泳、轉膜反應，滴加1∶800 的抗體：SOCS1、JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3、IL-17、RORγt、IL-23、IL-6 一抗及1∶1 000 的內參β-actin抗體，4 ℃濕盒孵育過夜，滴加HRP羊抗兔二抗（1∶1 500）室溫孵育2 h，增強化學發光法顯色曝光后，Image J軟件分析條帶相對表達。

1.4 統計學方法

采用SPSS 24.0 軟件對數據進行統計分析；符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示；多組間比較行單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 雷公藤紅素對小鼠搔抓次數及耳部皮膚炎癥癥狀評分的影響

與正常對照組相比，模型組小鼠耳部皮膚增厚、紅斑、水腫充血、干燥鱗屑等皮炎癥狀加重，皮炎癥狀評分升高，搔抓次數增多（P＜0.05）。與模型組相比，雷公藤紅素組小鼠皮炎癥狀評分降低，搔抓次數減少（P＜0.05）；si-SOCS1 組小鼠皮炎癥狀評分升高，搔抓次數進一步增多（P＜0.05）。與雷公藤紅素組相比，聯合組小鼠皮炎癥狀評分升高，搔抓次數增多（P＜0.05），見表1。

表1 小鼠皮炎癥狀評分及搔抓次數比較 ±s，n=10

表1 小鼠皮炎癥狀評分及搔抓次數比較 ±s，n=10

與正常對照比較，*P＜0.05；與模型組比較，**P＜0.05；與雷公藤紅素組比較，#P＜0.05。

2.2 雷公藤紅素對小鼠耳部皮膚組織病理損傷的影響

正常對照組小鼠耳組織結構清晰正常，無病理癥狀。模型組小鼠耳組織表皮層增生、棘細胞層變厚、組織水腫充血、毛細血管擴張、炎癥細胞浸潤等病理癥狀明顯；雷公藤紅素組小鼠上述病理損傷較模型組減輕；si-SOCS1組小鼠上述病理損傷相較模型組進一步加重。聯合組小鼠上述病理損傷較雷公藤紅素組嚴重，見圖1。

圖1 小鼠耳部皮膚組織病理損傷圖（HE染色，×200）

2.3 雷公藤紅素對小鼠血清IL-4、TNF-α、IgE 水平的影響

與正常對照組相比，模型組小鼠血清IL-4、TNF-α、IgE水平升高（P＜0.05）。與模型組相比，雷公藤紅素組小鼠血清IL-4、TNF-α、IgE 水平降低（P＜0.05）；si-SOCS1 組小鼠血清IL-4、TNF-α、IgE水平進一步升高（P＜0.05）。與雷公藤紅素組相比，聯合組小鼠血清IL-4、TNF-α、IgE 水平升高（P＜0.05），見表2。

表2 小鼠血清IL-4、TNF-α、IgE水平比較 ±s，n=10

表2 小鼠血清IL-4、TNF-α、IgE水平比較 ±s，n=10

與正常對照比較，*P＜0.05；與模型組比較，**P＜0.05；與雷公藤紅素組比較，#P＜0.05。

2.4 雷公藤紅素對小鼠耳部皮膚組織T 淋巴細胞浸潤的影響

CD3陽性表達可反映T淋巴細胞浸潤情況。與正常對照組相比，模型組小鼠耳部皮膚組織CD3陽性表達升高（P＜0.05）。與模型組相比，雷公藤紅素組小鼠耳部皮膚組織CD3 陽性表達降低（P＜0.05），si-SOCS1 組小鼠耳部皮膚組織CD3 陽性表達進一步升高（P＜0.05）。與雷公藤紅素組相比，聯合組小鼠CD3陽性表達升高（P＜0.05），見圖2、表3。

表3 小鼠CD3陽性表達變化比較 ±s，n=10

表3 小鼠CD3陽性表達變化比較 ±s，n=10

與正常對照比較，*P＜0.05；與模型組比較，**P＜0.05；與雷公藤紅素組比較，#P＜0.05。

圖2 小鼠耳部皮膚組織CD3陽性表達圖（免疫組化染色，×200）

2.5 雷公藤紅素對小鼠耳部皮膚組織SOCS1 及上游靶基因miR-155表達的影響

SOCS1 陽性表達為棕黃色顆粒。與正常對照組相比，模型組小鼠耳部皮膚組織棕黃色顆粒減少，SOCS1 陽性表達、SOCS1 基因及蛋白表達降低（P＜0.05）；miR-155表達升高（P＜0.05）。與模型組相比，雷公藤紅素組小鼠耳部皮膚組織SOCS1陽性表達、SOCS1基因及蛋白表達升高，miR-155表達降低（P＜0.05）；si-SOCS1 組小鼠耳部皮膚組織SOCS1陽性表達、SOCS1基因及蛋白表達進一步降低，miR-155 表達進一步升高（P＜0.05）。與雷公藤紅素組相比，聯合組小鼠耳部皮膚組織SOCS1陽性表達、SOCS1基因及蛋白表達進一步降低，miR-155表達進一步升高（P＜0.05），見圖3、表4、圖4。

圖3 小鼠耳部皮膚組織SOCS1蛋白表達圖

圖4 小鼠耳部皮膚組織SOCS1免疫組化染色圖（×200）

表4 小鼠miR-155、SOCS1基因及蛋白表達變化比較 ±s

表4 小鼠miR-155、SOCS1基因及蛋白表達變化比較 ±s

與正常對照比較，*P＜0.05；與模型組比較，**P＜0.05；與雷公藤紅素組比較，#P＜0.05。

2.6 雷公藤紅素對小鼠耳部皮膚組織SOCS1 通路下游JAK-STAT3通路及炎癥因子表達的影響

與正常對照組相比，模型組小鼠耳部皮膚組織p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3、IL-17、RORγt、IL-23、IL-6 蛋白表達升高（P＜0.05）。與模型組相比，雷公藤紅素組小鼠耳部皮膚組織p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3、IL-17、RORγt、IL-23、IL-6 蛋白表達降低（P＜0.05）；si-SOCS1 組小鼠耳部皮膚組織p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3、IL-17、RORγt、IL-23、IL-6 蛋白表達進一步升高（P＜0.05）。與雷公藤紅素組相比，聯合組小鼠耳部皮膚組織上述指標均升高（P＜0.05），見圖5、表5。

圖5 小鼠耳部皮膚組織p-JAK1、JAK1、p-STAT3、STAT3、IL-17、RORγt、IL-23、IL-6蛋白表達比較

表5 小鼠耳部皮膚組織p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3、IL-17、RORγt、IL-23、IL-6蛋白表達變化比較 ±s

表5 小鼠耳部皮膚組織p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3、IL-17、RORγt、IL-23、IL-6蛋白表達變化比較 ±s

與正常對照比較，*P＜0.05；與模型組比較，**P＜0.05；與雷公藤紅素組比較，#P＜0.05。

3 討論

AD 治愈率較低，且在兒童中發病率較高。目前研究發現，活化的T 淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞相互作用，介導的炎性反應活化，是AD皮膚損傷的關鍵機制[10]。Wu 等[11]認為變應原與皮膚接觸形成復合物后，可誘導皮膚中抗原呈遞細胞活化后將變應原呈遞給給T 淋巴細胞，刺激T 淋巴細胞活化后向Th2細胞亞群轉化并釋放IL-4、IL-17等炎癥因子來加劇皮膚損傷。另外，T 淋巴細胞向Th2細胞亞群擴增的同時，還會促進B細胞的轉換，識別特定環境變應原的IgE 抗體，從而引起Ⅰ型超敏反應。裴小平等[12]發現，AD 患者血清IgE、TNF-α 及IL-4、IL-7等炎癥因子水平異常高于正常人群，并認為IgE、TNF-α及IL-4、IL-17水平越高，AD患者病情越嚴重。本研究發現，模型組小鼠血清IgE、TNF-α及IL-4、IL-17 水平升高的同時，皮膚組織T 淋巴細胞表面標志CD3陽性表達也升高，小鼠搔抓次數升高，皮膚增厚、紅斑、充血水腫、干燥鱗屑等皮炎癥狀評分及皮膚表皮層增生、炎癥細胞浸潤等病理癥狀升高，提示小鼠出現瘙癢、紅斑、水腫等類似人類AD樣癥狀、皮膚T淋巴細胞活化及炎癥損傷現象，表明造模成功。抑制皮膚炎癥損傷，調節免疫反應是目前AD臨床廣泛接受的治療策略[13]。雷公藤紅素為雷公藤中的活性成分之一，現代臨床研究發現其具有較好的抗炎及調節免疫作用。余玲等[14]發現雷公藤紅素可通過抑制巨噬細胞產生的炎癥反應來改善自身免疫性疾病，如類風濕性關節炎患者的炎性損傷。陳保疆[5]發現，雷公藤紅素可體外促進AD小鼠致敏性T淋巴細胞凋亡，阻斷變態反應的發生，預示雷公藤紅素可能為治療AD 的潛在藥物。本研究給予小鼠一定劑量的雷公藤紅素干預治療后，發現小鼠血清炎癥因子IgE、TNF-α及IL-4、IL-7降低，皮膚組織中T淋巴細胞表面標志CD3陽性表達降低，搔抓次數及皮膚炎癥評分降低，光鏡下可見皮膚表皮層增生及炎癥細胞浸潤等病理損傷也明顯緩解，表明雷公藤紅素在治療AD 方面有潛在應用價值。

SOCS1/JAK-STAT3 通路是介導機體免疫炎性反應的重要通路之一。大量研究發現，SOCS1的激酶抑制區域序列，可抑制JAK2 激酶對STAT3 的激活，而阻止IL-23 和IL-17 的產生，減輕組織的炎性破壞[15]。另外，免疫原及變態原刺激機體分泌炎性因子如IL-6或IL-23等刺激JAK-STAT通路，生成活化的p-STAT3 來促進T 淋巴亞群中的Th17 轉錄因子-RORγt表達，而促進IL-17等炎癥因子表達，而加重機體免疫性疾病的發生[16]。李媛媛等[17]發現，抑制JAK-STAT3 通路活化，可改善AD 皮損癥狀。常晶等[7]發現，AD 患者血清SOCS1 表達降低，而上游靶基因miR-155表達升高，上調AD小鼠miR-155表達，來進一步抑制SOCS1表達后，小鼠AD癥狀進一步加重。Luan 等[18]發現，SOCS1 的產生，可與JAKs結合來抑制IL-4、IL-6 等刺激所產生的JAK-STAT信號級聯反應的過度激活，從而緩解組織損傷。本研究發現，AD模型組小鼠耳部皮膚組織中miR-155表達升高，SOCS1 表達降低，其下游JAK-STAT3 通路及T 淋巴活化相關促進因子IL-23、IL-17、IL-6、RORγt 表達均升高，小鼠皮膚AD 樣炎癥損傷均升高，相應的繼續敲除小鼠機體SOCS1 基因表達后，小鼠背部皮膚組織JAK-STAT3 通路及T 淋巴活化相關促進因子表達均升高，小鼠AD 癥狀也進一步加重，提示SOCS1表達降低，JAK-STAT3持續激活，可能是AD 小鼠T 淋巴細胞活化，介導的皮膚炎癥損傷加重的原因之一。雷公藤紅素組小鼠耳部皮膚組織SOCS1表達升高，JAK-STAT3通路及T淋巴活化相關促進因子表達均降低，提示雷公藤紅素改善AD皮膚炎癥癥狀，可能與上調SOCS1表達、抑制JAK-STAT3 通路及T 淋巴活化有關。雷公藤紅素與SOCS1基因敲除干預聯合治療后，雷公藤紅素的上調SOCS1 表達和抑制JAK-STAT3 通路活化作用，被明顯削弱，進一步表明雷公藤紅素治療AD小鼠皮膚炎癥損傷的作用，可能與干預SOCS1/JAKSTAT3通路活化有關。

綜上所述，雷公藤紅素可上調SOCS1 表達，抑制JAK-STAT3 通路激活，阻斷T 淋巴細胞活化，改善AD小鼠皮膚炎癥癥狀，為雷公藤紅素在AD領域的治療提供一定依據。但T淋巴細胞活化介導的皮膚炎癥反應機制復雜，涉及多條通路共同調節，雷公藤紅素發揮抗過敏作用，改善蕁麻疹癥狀的其他機制還需進一步探究。