生物大分子相分離及其在神經退行性疾病中的研究進展

崔理立（廣東省衰老相關心腦疾病重點實驗室，廣東湛江 524001）

生物大分子的相分離現象是當前生物學領域的研究熱點。自從第一個無膜的細胞器——核仁在細胞核被發現，研究者們陸續在細胞中發現了許多形態、動力學以及組裝的方式上極為類似的無膜或者半膜的“隔間”，這就是生物大分子的液‐液相分離現象(LLPS)。盡管它們的組成成分、定位及功能各不相同，卻大多具有與周圍介質進行快速、高效物質交換的性質，而如何在物理及分子角度對此種現象的生物學機制作出解釋一直未有突破性進展。2009 年Brangwynne 用相分離理論首次闡述了線蟲受精卵細胞極化和不對稱分裂機制，研究者逐漸認識到相分離可能是一個細胞內無膜隔間形成的普遍機制且參與了生物分子的組織定位與功能調控。而今生命體通過生物分子相分離產生具有各種功能的高度動態且無膜細胞器的概念正被廣泛接受，相分離機制在正常生命活動及致病機制中的重要作用逐漸明晰。本文將簡介相分離研究進展、生物學機制及其在神經退行性疾病中的研究狀況，展望未來研究的發展方向。

1 相分離現象

“相”是物理化學中描述物質統一特性的名詞，是指物質處于連續均一的聚集狀態，比如氣態、固態、液態就是最常見的相。相一般具有明確的邊界界定，出現自主的分離或聚集的現象稱之為“相分離”。常見的油水分離就是典型相分離現象，然而相分離并不局限于像水這樣的小分子，生物大分子同樣也可以經歷類似的過程，其中液‐ 液相分離是生物大分子相分離中的一種主要類別。LLPS 本質上是指生物大分子的各種液滴在另一種液體（細胞質或核質）中自組裝，即在大體積溶劑中分離成不同的液相，其通常發生在飽和濃度以上時，兩個不同的相就會發生分離，從而導致一個相的分子高度集中，而另一個相則相對稀薄，結構類似于液滴一樣的球狀，當彼此接觸時會結合成一個更大的球形組件，像水滴在疏水表面上形成的液珠一樣[1]。這種微觀物理化學現象貫穿于整個生命過程。

2009 年，Brangwynne 教授團隊在研究秀麗隱桿線蟲的發育機制時發現受精后的線蟲胚芽細胞的細胞核周圍出現許多發光的球狀小點，即P 顆粒[2]。P 顆粒由蛋白質和RNA 組成，能夠快速地與細胞質進行持續的物質交換，并且能夠在剪切力的作用下自由流動，相互碰撞并發生融合或分離。此研究提示生物體內同類物質之間存在一種新型的快速集散方式，在應力剪切的作用下可以發生形變并具有流動性，并首次通過相分離現象闡明線蟲胚芽細胞極化和不對稱分裂的機制。

細胞是生物體從事生理活動的場所和基本單位，細胞中蘊含著蛋白質、核酸、脂肪等復雜海量的生化物質，看似散漫卻又能夠井然有序的發生自主的相互作用，在細胞內行使各自的生物學功能。這些物質是如何找到各自的伙伴繼而團結在一起有序的工作？經典的有膜細胞器如線粒體、高爾基體、內質網等似乎為此提供了解答，但卻顯然無法簡單解釋全部的工作過程。在細胞中還存在著一些無膜細胞器如核仁、中心體等“生物分子凝聚物”，它們具有類似液體的性質，可以自由地進行變形、重組和融合，方便物質的交換和聚集，能發生液‐液相分離，在看似無序的細胞中形成秩序并能夠高效地參與細胞的生理過程[3‐4]。這類生物分子凝聚物是如何自主地聚集在一起，又是如何根據不同的應激來改變狀態發揮其生物學功能的，有待深入探討。而在外界應激或者基因突變等情況下，即在錯誤的時間或空間里，這類生物分子凝聚物出現相分離變化就可能會誘發一些分子堵塞、聚集，由此形成的不良液滴，可能會形成特定的分子病理機制，且與某些疾病的發生、發展密切相關，如一些由蛋白質聚集引起的神經退行性疾病等[阿爾茨海默病(AD)、路易小體病等]，因此探尋液‐液相分離的分子機制對于了解生物大分子在體內的具體功能模式及疾病的發病機制和防治都具有重要意義。

2 生物大分子中相分離現象的基本影響條件

生物大分子的液-液相分離一般由多價相互作用如疏水相互作用、離子相互作用等介導形成，其中包含了蛋白質之間的相互作用以及蛋白與核酸之間的相互作用等。這些多價相互作用最終在細胞內的局部區域自主富集形成生物分子凝聚物，即無膜細胞器。目前已經報道的一些典型無膜細胞器包括P 顆粒、中心體、紡錘體、應激顆粒、加工小體等[3]。然此類生物分子雖因自身的理化性質可發生相分離現象，但其凝聚物的形成與調控仍受眾多微環境因素的影響。目前針對生物大分子相分離的研究主要是以蛋白質為核心的，具有相分離潛質的蛋白通常可以通過評估該蛋白是否包含低復雜度結構域(LCD)亦稱低復雜度區域(LCR)，也就是固有無序區域(IDR) 來進行預測，這些無序區域可以釋放更多的多價作用力，在蛋白功能和濃度變化時會出現相分離的現象。如一種RNA 解旋酶—胚芽顆粒蛋白DDX4，其N 端和C 端都含有IDR，在體外表達純化DDX4，僅N 端的IDR 就足以使其發生相分離，并且低溫和低鹽濃度都會促進相分離液滴的形成[5]。此外，肌萎縮側索硬化癥(ALS)和應激顆粒相關的蛋白hnRNPA1，肉瘤融合蛋白(FUS)和TAR DNA 結合蛋白(TDP43)等[6‐7]都富含IDR 序列，能夠在體外驅動液‐液相分離的發生。研究發現具有高度保守結構域同時模塊相對獨立線性的蛋白能夠通過固有模塊的相互作用驅動相分離的發生，如Li 等[8]發現Src 同源3 結構域(SH3)可與富含脯氨酸基序(PRM)配體之間存在相互作用，在高濃度時將SH34和PRM4混合在一起后就會發生液‐液相分離，證實多價大分子(包括多結構域蛋白質和RNA) 之間的相互作用會產生明顯的液‐ 液相分離。

一般來說，相分離現象是生物大分子本身的理化性質與微環境共同促成的。當生物大分子的濃度達到其本身相分離的最低濃度時，生物分子會由于相互的吸引作用而凝聚達到臨界值，就可能發生相分離現象，而臨界飽和濃度越低說明體系越易于發生相分離。除此之外，溫度對于相分離的影響也不言而喻，相分離本質來說是體系熵減少的過程，溫度升高認為不利于相分離的進行。離子強度對于相分離的影響主要體現在離子的靜電作用，這取決于相分離體系中的哪種作用力起到主要作用。如果相分離體系中靜電作用處于主導，那么提高離子強度則不利于相分離的發生，然不同的鹽離子類型對于相分離影響是不同的，要具體情況具體分析[9]。此外，pH 值也可通過影響蛋白質的非共價相互作用影響相分離。綜上所述，在生物大分子的相分離體系中只有少部分關鍵大分子在分子內部或者分子之間通過多價相互作用主導著液‐液相分離現象的發生，且此現象高度依賴于溶液中生物大分子的理化性質和濃度、溫度、pH、離子類型、離子濃度及溶液中存在的其他物質等多種因素的準確配比和調控[9]。

3 生物大分子相分離現象背后的生物學及病理學機制

一些基因突變或環境干擾可導致凝聚體的形成和擾亂，進而影響生物學進程或者疾病的分子病理進程。目前已有多種影響蛋白大分子凝聚物的液‐液相分離機制報道，如直接改變凝聚體組裝的分子機制、改變凝聚反應的關鍵調節因子的活性、以及改變細胞內的理化條件等參與到細胞信號轉導、基因轉錄調控、染色質聚集及DNA 損傷調控這些生化或者病理進程中[10]。如一些蛋白的翻譯后修飾能夠抑制或者促進相分離過程。漸凍癥的關鍵致病蛋白Fus 蛋白在壓力刺激或者突變下，其精氨酸殘基可發生二甲基化修飾，使相關致病蛋白動態相分離調控紊亂，導致蛋白進行液‐固相轉化并產生高度穩定的致病淀粉樣聚集體[11‐12]。脆性X 智力障礙蛋白(FMRP)固有無序區域的磷酸化可以影響其與核酸之間的多價作用力，進而影響神經元顆粒的形成[13]。與腫瘤密切相關的轉錄因子YAP 相分離顆粒可以通過疏水作用凝集其相關轉錄因子和組蛋白修飾酶等復合體促進YAP 靶基因高效表達[14]。轉錄共激活因子含溴結構域蛋白(BRD4)和介體復合物亞基 1(MED1)可在體外形成相分離液滴，在超級增強子驅動的轉錄位點凝結而將轉錄裝置分隔從而實現轉錄過程的的區室化，使轉錄過程高效進行[15]。增強子RNA 依賴性核糖核蛋白復合物在人類乳腺癌細胞中表現出液體樣凝聚物的特性，提高了對轉錄程序的反應速度和程度[16]。據報道相分離機制參與了一些信號通路的激活，如T 細胞受體(TCR)信號通路被激活時，下游效應蛋白自發地相分離形成動態的膜相關cluster，從而放大傳入信號[17]。抑制基因SPOP(斑點型BTB/POZ 蛋白) 突變可破壞SPOP 底物的相互作用，進而破壞SPOP 的相分離和無膜細胞器的定位，促進腫瘤的發生[18]。有研究發現相分離也參與調控傳染病的發生和發展，如水皰性口炎病毒感染時形成的隔室具有類似液體的性質，參與復制的三種病毒蛋白質可通過相分離以驅動病毒隔室的形成[19]。狂犬病病毒感染的細胞胞質中形成的內基氏小體是由狂犬病病毒P蛋白中的IDR 驅動形成的液滴，它能夠進一步地促進病毒基因組的復制[20]。亦有研究提出在眼球晶狀體內蛋白質的液態凝集物可致白內障形成[21]。可見，生物大分子中液‐液相分離的本質是通過蛋白等生物大分子在胞內自發的凝集與分離從而高效地發揮生物學功能，此一精細物理化學現象的生物學闡釋，對于了解復雜的細胞功能和某些疾病的發生、發展具有重要意義。

4 神經退行性疾病中的生物大分子相分離現象

神經退行性疾病是一類神經元進行性變性死亡導致中樞神經系統受損從而影響患者的認知及運動功能的疾病，主要包括AD、帕金森氏病、亨廷頓氏病、多發性硬化癥、肌萎縮側索硬化癥(ALS)和額顳葉癡呆(FTD)等。此類疾病因大腦和脊髓神經元細胞的喪失而不可逆轉，在臨床上以發作遲緩和選擇性神經元的功能障礙為主要表現特征[22]。大量研究表明上述神經退行性疾病均與錯誤折疊蛋白的聚合和沉積有關[23]，如AD 中微管相關蛋白Tau(MAPT)的胞漿聚集，ALS和FTD 中TAR DNA 結合蛋白(TDP‐43)或FUS 胞漿內的包涵體，以及HD 中的聚谷氨酰胺(PolyQ)聚集體等。這些蛋白的病理性聚集均被認為是導致各種神經退行性病變的最重要因素[24‐25]。

神經退行性疾病中積聚的病理性蛋白大都屬于內在無序蛋白質(IDP)，如亨廷頓病中的亨廷頓蛋白、帕金森病中的α‐突觸核蛋白、ALS 中的TDP‐43 和FUS 蛋白以及Tau 相關病中的Tau 蛋白。IDP 沒有明確的三級結構[26]，常表現出構象異質性。含有內在無序區域的蛋白質通常具有多種生物學功能[27]，它們在各種構象中波動，僅在展開時具有生物活性，從而能夠參與多種信號通路的調節和信號的傳導過程。然而這些波動也使ID 容易受到環境變化的影響，并且由于它們的疏水區沒有埋在蛋白核心內，所以更傾向于通過異常構象聚集在淀粉樣蛋白原纖維中，最初的蛋白質液滴是高度動態的，不穩定的分子聚合小液滴之間會融合成更大、更穩定的液滴，隨著時間的推移會逐漸老化，而在老化過程的最后階段是向固體樣淀粉樣蛋白纖維的轉變，也就是形成蛋白聚集斑塊[28‐30]。淀粉樣蛋白纖維是神經退行性疾病的特征，然而與疾病相關的淀粉樣蛋白纖維是如何產生的又是如何導致神經退化的，這些問題隨著LLPS 在淀粉樣原纖維形成機制研究中受到的關注日益增長，可能將會有新的解答。近年來的研究表明異常的相分離和液‐固相變參與了病理性蛋白聚集體的形成，為這類難治之癥的診治提供了新的分子機制和潛在的治療靶點。

4.1 ALS 和FTD

ALS 和FTD 是涉及異常相分離的神經退行性疾病中最突出的例子之一，其中RNA 結合蛋白中的無膜細胞器和異常相變似在發病機制中發揮關鍵的作用[7]。TDP‐43、FUS 和hnRNPA1 均屬于異質性核糖核蛋白。研究發現TDP‐43 在ALS 患者大腦和脊髓的病變區域異常聚集形成泛素陽性包涵體，這被廣泛認為是散發性和大多數家族性ALS 的標志性病理[31]。在TDP‐43、FUS 和hnRNPA1 的低復雜度結構域中發現有與ALS 發病相關的突變位點。這些突變損害無膜細胞器的動力學，導致疾病相關RNA 結合蛋白發生相分離，進而加速了纖維化過程，最終形成沉積在細胞體和神經叢中的病理性淀粉樣原纖維[32‐35]。除了致病突變外，RNA 結合蛋白及其結合伴侶上的異常翻譯后修飾(PTM) 在ALS 和FTD 的病理機制上也發揮重要作用[36]。研究表明FUS 精氨酸甲基化的缺失促進了LLPS，并降低了體外和細胞中FUS 凝聚體的動力，其基本機制為精氨酸和芳香族氨基酸殘基間的相互作用增強，從而推動了FUS 蛋白的縮合，提示PTM 可以促進或抑制疾病相關蛋白的相分離[37‐38]。可見，針對各自的PTM 修飾酶影響關鍵相分離蛋白是一個很有前途的治療策略，如已有研究發現PAR 聚合酶抑制劑在TDP‐43 相關毒性的細胞和動物模型中具有神經保護作用[39]。研究表明亞細胞定位的改變可以改變蛋白質的相行為，從而導致ALS 或FTD 等疾病的發生，ALS疾病相關的FUS 蛋白的核定位信號(NLS)突變后會抑制FUS 與核輸入受體Transportin 的結合，可致核輸入受損和FUS 的胞漿積聚[40]。因此，糾正蛋白的錯誤定位和增強隔室特異性也可成為治療ALS 等疾病的一種潛在策略。

4.2 AD 以及其他TAU 病

Tau 是微管相關蛋白，在一系列神經退行性疾病的發病機制中起著關鍵作用。蛋白質聚集體是神經退行性疾病的標志，其中病理性Tau 蛋白的聚集是多種神經退行性疾病的典型病理特征[41‐43]。AD、進行性核上性麻痹、皮質基底膜變性、嗜銀顆粒病、某些形式的FTD 和慢性創傷性腦病等的關鍵組織病理學特征之一是在大腦中積累了不溶性的胞漿Tau 包涵體，而這些包涵體的主要類型便是這類疾病的典型病理‐神經原纖維纏結(NFT)[44]，因而這類疾病統稱TAU 病。

越來越多的證據表明，Tau 可以依靠LLPS 完成一些細胞功能。在健康的神經元中，Tau 相分離具有重要的生理功能，即局部濃縮微管蛋白，從而形成微管束[45]。然而Tau 異常聚集可導致從液體到固體的轉變，這與神經退行性疾病病理機制密切相關。那么極易溶的Tau 蛋白是如何轉變為NFT 中聚集的Tau？Tau 從微管分離被認為是Tau 病變的開始，與疾病相關的Tau突變或異常的PTM 使其向凝集狀態移動，并促進隨后的聚集和硬化。而Tau 的PTMs 中最重要的是磷酸化[46‐50]。為了應對病理壓力，磷酸化的游離Tau 不斷錯誤地定位并在樹突和胞體中積累，最終導致了Tau 蛋白的聚集[51]。

相分離被認為是Tau 蛋白聚集的初始步驟。有研究者提出可溶性Tau 蛋白可以在細胞條件下進行LLPS，并且相分離的Tau 液滴可以作為Tau 聚集形成的中間體[52]。研究證明，具有LCD 的幾種無序蛋白質在增加溶液中的大分子擁擠劑時會經歷LLPS，從而導致水溶液中液滴的形成[53]。雖然Tau 蛋白質序列中不存在典型的LCD，但是全長Tau 蛋白因存在的內在無序和不均勻的電荷分布[54]，Tau 蛋白也可以在體外通過擁擠劑或RNA 促進相分離的發生。在AD 和FTDP‐17 患者中，Tau 蛋白的異常過度磷酸化促進了Tau 蛋白的相分離[55]。Tau 蛋白與相分離相關的RNA 結合蛋白之間存在密切聯系，可單獨或在RNA 和/或蛋白質伴侶存在的情況下進行LLPS。研究表明在AD 和FTDP‐17 患者或小鼠模型中，TIA1 和其他RNA 結合蛋白與Tau 蛋白相互作用并參與Tau 蛋白聚集[56‐58]。鑒于Tau 的PTM 中磷酸化的最重要地位[59]，Tau 的過度磷酸化是促使其通過相分離在突觸定位錯誤而異常聚集的最主要因素。除此之外致病突變對Tau 的LLPS 也有重要作用，如17 號染色體上編碼Tau 的microtubule‐associated protein tau(MAPT) 基因的突變誘發FTD 并伴有帕金森綜合征(FTDP‐17)，該突變可通過Tau 與微管結合能力降低和/ 或蛋白質聚集傾向增強等機制促進疾病的發生和發展[61‐63]。在體外研究中大分子擁擠劑和高蛋白質濃度可促進Tau 相分離，且離子強度和溫度對其亦有影響[64‐66]，如鋅離子(Zn2+)會降低 LLPS 的 Tau 臨界濃度[67]，而多價陰離子輔助因子如RNA 或肝素等可通過帶負電的聚電解質和帶正電的中間/C 末端Tau 結構域之間的多價靜電吸引產生凝聚[68‐70]。

5 展望

從2009 年線蟲中P 顆粒的相分離現象被報道，將相分離引入到生物學領域，至今此一新興交叉領域的發展十分迅速。相分離的相關研究為深入理解生物體的生物學以及疾病的病理生理過程提供了新的啟示。盡管如此，在相分離領域仍存在一些關鍵問題亟待解決。首先是目前相分離研究的技術手段仍然處于發展之中，主要依賴于體內的成像觀察以及體外的理化性質評估與建模；主要的技術方法包括對相關蛋白或核酸分子熒光標記，體外組裝進行熒光漂白恢復實驗等。然而多數細胞內的相分離現象仍難以被直接觀察捕捉到，研究這類有相分離性質的無膜細胞器在體內的精細的調控機制和動態過程，需要開發新的實驗手段和表征方法。其次，生物大分子相分離作為新興的研究領域雖然已經有了越來越多的共識，但仍需要更加統一的研究標準，其作為物理學中的基本概念也需要更多的跨學科交叉研究定義。

細胞內的相分離機制到底對于生物進程以及疾病進程有多大的影響，是否可作為某一些疾病的關鍵機制，仍會是未來研究的最主要科學問題之一。在疾病中相分離機制研究的最終導向是對疾病的機制理解和治療。在明確相分離現象對于生理病理過程的影響后，如何對這一機制進行有效精準的干預是未來發展的重要問題。對于腫瘤的靶向治療，傳統的靶標大部分是具有明確活性口袋或活性位點，主要通過使用小分子占據驅動的藥理學作用模式影響蛋白功能。然而有許多腫瘤的靶標如K‐RAS、MYC 和P53 蛋白等由于缺乏可被小分子靶向的蛋白質口袋，傳統上被認為是難以成藥的[60]。鑒于已有研究發現一些不可成藥的靶點受到相分離的調控，那么針對這類蛋白的無序區域的相分離靶點設計藥物，有望成為治療相關疾病的新型策略。如Prasad 等[61]發現小分子吖啶衍生物AIM4 有很強的抗TDP‐43 聚集作用，AIM4 與TDP‐43無序區的氨基酸殘基結合以抑制其相分離。Dong 等[62]在SHP2 突變體異常相分離現象中發現SHP2 變構抑制劑ET070 可將SHP2 突變體鎖定在特定構象以抑制其相分離。Li 等[63]通過對SAS‐CoV‐2 病毒核殼蛋白的二聚化結構域進行研究，設計出了一種特異靶向二聚化結構域的干擾肽來破壞其相分離，進而抑制病毒復制，恢復先天免疫。綜上，由于相分離生物過程的高度復雜性，調節相分離的過程進而治療疾病的分子種類也是多樣的，包括小分子、抗體和人工合成肽等可以通過靶向無序區、結構域或調節變構等途徑調節相分離，這對疾病的治療也許會得到意想不到的突破。

盡管我們目前對于生物大分子相分離現象在生命過程中扮演的角色知之甚少，但我們相信隨著科學家的不斷探索和技術的不斷進步，這一領域的進展將會真正推動疾病的機制研究和靶點的開發。

志謝：感謝課題組陸星宇碩士和李勝男博士對本文撰寫的支持與協助。