HPLC法測定不同產地、不同干燥法葛根中主要異黃酮類成分的含量

朱智蕓，趙 毅，車彥云，王自梁

(1.云南經濟管理學院 醫學院，云南 昆明，650000；2.云南中醫藥大學 中藥學院，云南 昆明, 650500；3.云南民族大學 民族藥資源化學國家民委-教育部重點實驗室，云南 昆明 650500)

葛根為豆科植物野葛Puerarialobata(Willd.)Ohwi的干燥根，習稱野葛.味甘、辛、涼，歸脾、胃、肺經，具有解肌退熱，生津止渴，透疹，升陽止瀉，通經活絡，解酒毒等功效[1].葛根的主要成分是異黃酮類化合物，包含葛根素、大豆苷、大豆苷元、三萜類和芳香類等成分[2-3]，其中主要活性成分葛根素、大豆苷和大豆苷元[4-6]，具有改善心腦血管循環、擴張冠狀動脈、抗心肌缺血、減慢心率、降低心肌耗氧量、抗脂質過氧化和消除自由基、降血糖降血脂、防止骨質疏松、保護腦缺血及缺血再灌注引起的神經細胞損傷等作用[7-14].在中國，葛根資源豐富，除西藏、新疆等地外，其它地區均有分布，但不同的生長環境葛根成分含量不同[16].云南產葛根中異黃酮類成分的含量的測定雖有相關報道，但樣品產地單一，并沒有進行多個產地系統的比較，尚不能很好的說明問題.本實驗所用葛根樣品分別為云南曲靖品種、建水品種、牟定品種、牟定種植的廣西品種和牟定種植的曲靖品種，并與陜西、山西、廣西產的葛根做對比，更能說明云南不同產地葛根中主要有效成分含量的情況.干燥處理有利于葛根的貯存，目前最常用的干燥方法是烘干和自然風干，但不同干燥方法對葛根中異黃酮類化合物的含量影響不同[15].本實驗建立一種同時測定葛根中葛根素、大豆苷和大豆苷元含量的方法，并用這種方法測定不同產地、不同干燥方法葛根中葛根素、大豆苷和大豆苷元的含量，為云南葛根藥材的質量控制標準建立、生長條件研究、種植、貯存及開發利用提供有效依據.

1 材料、儀器與試劑

1.1 材料

1.2 儀器

Agilent 1260 HPLC(美國安捷倫公司)；超純水制備儀(深圳宏森環保有限公司)；恒溫真空干燥箱D27-6020(上海精宏實驗設備有限公司)；數控超聲波清洗器KQ-700TDV(昆山市超聲儀器有限公司)；電子天平ML204/02(上海梅特勒托利多儀器公司).

1.3 試劑

葛根素、大豆苷、大豆苷元對照品均購買于中國食品藥品檢定研究院.甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純.

2 實驗方法

2.1 色譜條件

色譜柱Symmetry C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，以甲醇-水溶液作為流動相梯度洗脫(見表1)，流速 0.7 mL/min，柱溫 30 ℃，檢測波長 250 nm.

表1 梯度洗脫條件

2.2 葛根粉的制備

將8個產地的葛根洗凈，去除表面泥沙，切成小塊，8個產地的葛根一部分于 50 ℃ 烘干、一部分自然風干，粉碎，過 0.301 mm 篩后保存備用.

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取葛根素 4 mg，大豆苷 0.53 mg 及大豆苷元 0.27 mg，置于 10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解，定容，然后吸取 5.0 mL 置于 10 mL 容量瓶中，定容，作為對照品溶液.

2.4 供試溶液的制備

分別精密稱取葛根粉末各 0.20 g，加入50%乙醇 20.0 mL，超聲提取 40 min，過濾，用50%乙醇洗滌，將濾液蒸干，再用50%乙醇溶解并定容至 5 mL 容量瓶中.經 0.45 μm 微孔濾膜過濾后作為液相色譜供試溶液.

2.5 方法學考查

2.5.1 線性關系

教師的教學方式單一是影響教學質量和教學效果的重要原因。很多教師在教學過程中往往采用“灌輸式”的教學方式，只注重教師講課的連貫性，忽視了與學生之間的交流和溝通，導致課堂教學氣氛沉悶。此外，這種方式也忽視了實踐性教學的重要性，沒有將道德與法治課堂知識與生活結合，學生在理解時不夠深入[1]。

取2.3項下對照品母液，分別精密吸取0.5、1.5、3.0、4.5、6.0和 7.5 mL 置于 10 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋制刻度.取 10 μL 進樣，按色譜條件測定峰面積積分值，以峰面積積分值為縱坐標，進樣濃度為橫坐標繪制曲線，計算回歸方程.

2.5.2 精密度試驗

精密吸取對照品溶液 10 μL，重復進樣5次測定，以峰面積積分值分別計算葛根素、大豆苷和大豆苷元的RSD值.

2.5.3 穩定性試驗

精密吸取對照品混合液 10 μL，分別在0, 1, 4, 6,10 h 時進行測定，分別計算葛根素、大豆苷和大豆苷元的RSD值.

2.5.4 重復性試驗

取同一批樣品，平行配制5份供試品溶液，進樣 10 μL.分別計算葛根素、大豆苷和大豆苷元的RSD值.

2.5.5 回收率試驗

精密稱取葛根粉末 0.1 g，共4份，其中3份各加 0.410 mg 葛根素、0.256 mg 大豆苷及 0.048 mg 大豆苷元，另1份不加對照品，按供試溶液的制備法提取，定容.按色譜條件進樣測定，計算回收率及其RSD值.

3 結果與討論

3.1 色譜條件的優化

流動相的種類、pH值、流速以及柱溫等因素可影響目標化合物的分離效果和保留時間.本實驗通過一系列篩選確定了適宜的色譜條件：甲醇-水作為流動相，流速 0.7 mL/min，柱溫 30 ℃，該色譜條件下，目標化合物峰達到良好的基線分離，峰型良好.異黃酮類化合物具有苯甲酰結構，在紫外 250 nm 左右有最強吸收，故選擇檢測波長為 250 nm.

3.2 方法學考查結果

3.2.1 線性關系

葛根素:Y=896.74x-35.468，r2=0.999 8，線性范圍20～300 mg/L.大豆苷:Y=182.54x-12.173，r2=0.999 7，線性范圍2.65～39.75 mg/L.大豆苷元:Y=81.019x-2.554 1，r2=0.999 6，線性范圍1.35～20.25 mg/L.結果表明，此方法在一定的濃度范圍內線性關系良好.

3.2.2 精密度試驗

葛根素、大豆苷和大豆苷元的RSD值分別為0.28%，0.57%，0.46%，表明此方法精密度良好.

3.2.3 穩定性試驗

葛根素、大豆苷和大豆苷元的RSD值分別為1.79%，0.95%，0.92%，表明 10 h 內葛根素、大豆苷及大豆苷元穩定性良好.

3.2.4 重復性試驗

葛根素、大豆苷和大豆苷元的RSD值分別為0.47%，0.65%，0.88%(n=5)，表明此方法重復性良好.

3.2.5 回收率試驗

葛根素、大豆苷和大豆苷元的平均加樣回收率分別為109.1%、99.0%和106.3%，RSD值分別為0.99%，1.80%，1.93%.詳見表2.

表2 葛根樣品回收率測定結果

3.3 樣品的測定

精密吸取 10 μL 供試溶液進樣，測定色譜峰峰面積積分值，計算含量，測定結果見表3.葛根素、大豆苷及大豆苷元對照品的HPLC色譜圖見圖1，葛根樣品的HPLC色譜圖見圖2.

表3 8個不同產地葛根樣品中葛根素、大豆苷及大豆苷元含量的測定結果 (mg·g-1)

圖1 葛根素、大豆苷、大豆苷元對照品HPLC圖譜 圖2 葛根樣品HPLC圖譜

4 結語

本實驗色譜條件下，樣品各物質峰達到良好的基線分離，峰型良好.經方法學考察，表明該方法具有簡便、準確和快速的優點，可以用于葛根藥材中葛根素、大豆苷和大豆苷元的含量測定，為葛根藥材的質量評價奠定基礎.

不同產地葛根藥材中葛根素、大豆苷和大豆苷元3種成分總含量比較：陜西﹥云南牟定﹥云南牟定種植的曲靖品種﹥云南牟定種植的廣西品種﹥云南建水產的葛根﹥云南曲靖﹥江西﹥廣西，這表明環境差異對葛根的生長有較大影響.同一產地、不同干燥方法制得的葛根藥材中葛根素、大豆苷和大豆苷元3種成分總含量比較：烘干﹥自然風干，這可能與干燥過程中的空氣溫度、流速和濕度等因素有關，有待后續研究驗證.本文研究結果可為云南優良葛根資源的采集、栽培和利用提供技術支撐.