犬弓首蛔蟲Tc-PEBP的分子特性及組織表達分析

李芳，陳紹基，譚純，梅四鵬，賈紅菓，周榮瓊

西南大學 動物醫學院，重慶 榮昌 402460

犬弓首蛔蟲Toxocaracanis是一種寄生在犬及犬科動物小腸內的寄生蟲，其感染性蟲卵或幼蟲是弓首蛔蟲病(Toxocariasis)的病原體[1]．弓首蛔蟲病是一種人獸共患寄生蟲病，人和其他哺乳動物主要通過意外攝入含有T.canis感染性幼蟲或蟲卵的食物而感染[2]．作為非特異性宿主，人感染后感染性蟲卵可以在小腸內發育成為L2幼蟲，但不能發育為成蟲，L2幼蟲穿過宿主小腸壁黏膜，通過循環系統移行進入機體肺臟、肝臟、肌肉和大腦等各種器官、組織中，造成器官和組織的損傷，引發宿主的免疫和炎癥反應[3-4]，從而出現不同的臨床癥狀，如隱性弓首蛔蟲病(covert toxocariasis，CT)、神經弓首蛔蟲病(neurological toxocariasis，NT)、內臟幼蟲移行癥(visceral larva migrans，VLM)及眼睛幼蟲移行癥(ocular larve migrans，OLM)等[5-6]，嚴重危害人類的身體健康．

磷脂酰乙醇胺結合蛋白(phosphatidylethanolamine binding protein，PEBP)是一個高度保守的多功能堿性胞質蛋白，其表面具有一個狹窄的空腔，是重要的配體結合位點，可結合膜磷脂、核苷酸、三磷酸腺苷等多種物質，參與維持細胞穩態，調節細胞分化、遷移和黏附等多種生物學功能[7-9]．在寄生蟲中，磷脂酰乙醇胺結合蛋白(PEBP)可參與細胞的生長、發育、繁殖和信號傳導等．如寄生惡性瘧原蟲PEBP能促進蟲體的生長、發育和繁殖等[10-11]；肝片吸蟲磷脂酰乙醇胺結合蛋白通過與CD14受體進行結合來抑制p38蛋白、細胞外調節蛋白激酶(ERK)和應激活化蛋白激酶(JNK)的磷酸化，從而抑制LPS誘導的炎性反應，具有免疫調節特性[12]．犬弓首蛔蟲磷脂酰乙醇胺結合蛋白(Tc-PEPB)的研究未見報道，本研究通過克隆、鑒定Tc-pebp全長基因，采用qRT-PCR技術對犬弓首蛔蟲各組織進行轉錄差異水平分析，以期為探討Tc-PEBP蛋白的功能奠定基礎．

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 犬弓首蛔蟲樣本

犬弓首蛔蟲蟲體樣本采自西南大學動物醫學院動物醫院某患病犬．蟲體用37 ℃滅菌的生理鹽水洗滌去除雜質后，經形態學鑒定，將成熟的T.canis雌蟲卵巢進行解剖，收集蟲卵，在37 ℃培養箱中培養3～4周后，蟲卵發育為L2期幼蟲[13]．

1.1.2 主要試劑

DH5α、EasyPure?膠回收試劑盒購自TransGen Biotech(全式金)公司；T-Vector pMD19(simple)、PrimeScriptTM反轉錄試劑盒、Taq DNA聚合酶均購自TaKaRa公司；Trizol試劑購自Invitrogen(賽默飛)公司．

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取與反轉錄

通過形態學和分子生物學的方法對雌、雄蟲進行鑒定，解剖和分離雌、雄蟲的腸道，肌肉，體壁，生殖道等各個組織．取出液氮提前預冷研缽，分別加入雌、雄蟲體各組織和L2幼蟲，在液氮中充分研磨成粉末．取研磨好的粉末放入無RNA酶離心管中，使用傳統的Trizol法分別提取犬弓首蛔蟲成蟲、L2期幼蟲及各組織的RNA；采用Eppendorf核酸蛋白測定儀檢測得到總RNA的濃度和純度．以提取的T.canis及各組織的總RNA為模板，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit反轉錄試劑盒說明書來反轉錄合成cDNA，-20 ℃保存．

1.2.2Tc-pebp基因的克隆及分析

(1)引物的設計與合成

根據Tc-PEBP全長基因序列(GenBank No：AAC46843.1)，用Primer Premier 6.0 和Primer-BLAST軟件設計基因特異性引物并克隆其完整編碼序列．引物序列信息為F：5’-TTAGGCCTGCGATCGATAGAA-3’；5’-AAGATAGCTAGCGTCCGGATT-3’．引物序列送擎科興業生物技術有限公司(重慶)進行合成．

(2)Tc-pebp基因的PCR擴增

以反轉錄合成的T.canis成蟲及L2期幼蟲的cDNA為模板，進行PCR擴增．擴增體系為50 μL：上、下游引物(10 μM)各1 μL；Mg2+(25 mM)5 μL；10×PCR buffer(不含Mg2+)4.0 μL；dNTPs(2.5 mM)4 μL；模板(cDNA)2 μL；r×Taq酶(5 U/μL)1 μL；dd H2O 32.0 μL[14]．

PCR反應條件為：94 ℃ 3 min，94 ℃ 40 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環；72 ℃延伸5 min，擴增產物置于4 ℃保存．

(3)克隆及測序

PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，按照EasyPure?膠回收試劑盒說明書對目的PCR產物進行回收．將回收得到的目的基因片段與pMD19-T(simple)載體進行連接，并轉化至DH5α感受態細胞中．在37 ℃ 220 r/min的條件下震蕩培養60～90 min，培養結束后使用“L”型涂菌棒涂布于LB/Amp+固體培養基上(含有X-Gal和IPTG)，在37 ℃恒溫培養箱靜置30 min后倒置，過夜培養12～16 h．培養結束后，在平板上用接種環挑取單個白色菌落于含有900 μL LB/Amp+液體培養基的EP管中，在37 ℃ 220 r/min的搖床中過夜培養14～16 h．

(4)序列分析

重組菌液經PCR鑒定為陽性菌液的，將其送至擎科興業生物技術有限公司(重慶)進行測序．將測序結果通過生物大分子序列比對搜索工具(BLAST)進行同源性比對；登錄美國國家生物技術信息中心(NCBI)網站查找Tc-PEBP蛋白序列，并使用MAFFT，Clustal Omega和MUSCLE等軟件對Tc-pebp基因進行多重序列比較，通過使用MEGA 7.0軟件中的鄰接法(Neighbour-joining，NJ法)來對Tc-PEBP蛋白序列進行系統發育進化樹的構建，用Bootstrap對進化樹的可靠性進行分析，共1 000個重復；并使用蛋白數據庫SMART、PORTER和I-TASSER等軟件預測Tc-PEBP蛋白的二級結構和功能結構域．

1.2.3Tc-pebp基因的組織表達分析

根據T.canis基因組數據 (GenBank：AAC46843.1 )，用Primer Premier (Version 6.0 )軟件設計特異性引物并克隆其完整編碼序列，引物序列信息為F：5’-CGCATGTCAGTTGTACACAAA-3’，R：5’-GGTTAGGCCTGCGATCGATAGAA-3’．以18S 1：5’-AAAGGGCAGGGACGTAGTCAA-3’；18S 2：5’-AATTGTTGGTCTTCAACGAGGA-3’作為內參基因[15]．引物序列由擎科興業生物技術有限公司(重慶)合成．

以雌、雄蟲的肌肉、體壁、腸道及生殖道等各組織的cDNA為模板，分別用Tc-PEBP和18S rRNA引物進行實時熒光定量PCR．反應體系為50 μL：包括25 μL的SYBR Premix Ex Taq I；4 μL的 cDNA；上、下游引物各 2.0 μL；17 μL的ddH2O．PCR反應程序為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火32 s，共40個循環，循環結束后收集數據進行分析．

M：2 000 bp DNA相對分子質量標準； 1.雄蟲；2.雌蟲；3.L2期幼蟲；4.陰性對照．圖1 Tc-pebp基因的PCR擴增結果

2 結果與分析

2.1 Tc-pebp基因的克隆及鑒定

PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，Tc-pebp在約800 bp處可見相應條帶，與理論大小相符；陰性對照沒有條帶出現(圖1)．將測序獲得的堿基序列進行分析，結果顯示Tc-pebp基因的完整編碼區序列為789 bp，該序列含有一個完整編碼區，共編碼262個氨基酸，預測蛋白相對分子質量為2.6×104，功能結構域分析結果顯示1～20個氨基酸為信號肽，第22～58位、第59～94位為2個重復的ShKT結構域，第123～257位有PBP保守結構域(圖2)．

圖2 Tc-PEBP蛋白的結構域預測

2.2 多重序列比對及種系發育分析

通過WormBase ParaSite[16]和GenBank檢索，將Tc-PEBP蛋白氨基酸序列與4個線蟲的PEBP蛋白氨基酸序列進行多重序列比對．這些序列分別是豬蛔蟲Ascarissuum(GenBank No.AEUI03000057.1)、貝拉中桿線蟲Mesorhabditisbelari(GenBank No.UZWA01000301.1)、秀麗隱桿線蟲Caenorhabditiselegans(GenBank No.NP_001300105.1)、異尖線蟲Anisakissimplex(GenBank No.UYRR01001265.1)，結果發現均具有PBP保守結構域(圖3)．

圖3 Tc-PEBP蛋白氨基酸序列多重比對

將Tc-pebp編碼的氨基酸序列與通過WormBase ParaSite[16]和GenBank收錄的十二指腸鉤蟲Ancylostomaduodenale(GenBank No.KIH55180.1)、豬蛔蟲A.suum(GenBank No.AEUI03000057.1)、秀麗隱桿線蟲C.elegans(GenBank No.NP_001300105.1)、有齒食道口線蟲Oesophagostomumdentatum(GenBank No.KHJ93726.1)、貝拉中桿線蟲M.belari(GenBank No.UZWA01000301.1)、異尖線蟲A.simplex(GenBank No.UYRR01001265.1)、中華按蚊Anophelessinensis(GenBank No.KFB38652.1)、家蠅Muscadomestica(GenBank No.AFP60570.1 )、環紋背帶線蟲Teladorsagiacircumcincta(GenBank No.PIO76166.1)、致倦庫蚊Culexquinquefasciatus(GenBank No.EDS31592.1)、錫蘭鉤蟲Ancylostomaceylanicum(GenBank No.EPB80812.1)、毛首鞭形線蟲Trichuristrichiura(GenBank No.CDW52734.1)和豬鞭蟲Trichurissuis(GenBank No.KHJ46160.1)進行多重序列比對并構建進化樹，結果發現Tc-PEBP與貝拉中桿線蟲M.belari(GenBank No.PRJEB30104)形成一個單獨的分支，其進化關系較近(圖4)．

圖4 Tc-pebp編碼氨基酸序列的系統發育關系分析

2.3 結構及功能預測

利用I-TASSER構建Tc-PEBP蛋白的三維空間，其TM最高值為0.69±0.12，標準差為6.3±3.8?(圖5a)．根據I-TASSER顯示的空間結構及功能注釋，發現Tc-PEBP蛋白的結合位點為D159，F162，R173，H175，S198，T199，P200，H207和Y209(圖5b)．酶活性位點為G129，A165和T241(圖5c)．基因本體論注釋表明Tc-PEBP蛋白的分子功能為結合磷脂酰乙醇胺(GO：0008429)，生物學過程為調控有絲分裂(GO：0045840)和蛋白磷酸化(GO：0001933)，細胞組分為粗面內質網的必要組分(GO：0005791)．

圖5 Tc-PEBP蛋白的結構和功能預測

2.4 Tc-pebp的組織差異表達

使用18S rRNA引物作為內參基因，對T.canis雌、雄蟲的肌肉、體壁、腸道及生殖道等各個組織中Tc-pebp基因的轉錄水平進行分析，結果發現在雌蟲的卵巢、輸卵管、子宮、體壁、腸道和肌肉中均檢測到Tc-pebp基因的表達，其中卵巢的轉錄水平最高，其次是輸卵管，肌肉最低(圖6a)；雄蟲的Tc-pebp基因在腸道中表達量最高，在貯精囊中轉錄水平較低(圖6b)．

圖6 犬弓首蛔蟲Tc-pebp組織差異表達分析

3 結語

磷脂酰乙醇結合蛋白(PEBP)在許多生理和病理過程中有著重要的作用．如在哺乳動物體內，PEBP作為一種內源性Raf-1激酶抑制蛋白，可通過抑制細胞外調節蛋白激酶(ERK)通路的激活并與核轉錄因子-κB(NF-κB)上游信號分子進行結合，從而參與細胞的增殖、遷移、分化和機體的免疫防御反應等[17-19]．在植物體內，PEBP蛋白能夠長距離運輸，在頂端分生組織中誘導植物的開花并調控植物的生長發育[20-22]．在昆蟲體內，PEBP可抵御外界微生物的入侵，被證明與昆蟲的先天免疫防御有關[23]．

本研究發現，Tc-PEBP具有ShKT結構域(ShKT domain)和PBP結構域(PBP domain)(圖3)．ShKT結構域由6個保守的半胱氨基酸(SXC)組成，能夠促進其他分泌蛋白如黏蛋白的形成和聚合，參與寄生蟲的免疫逃避[24]．多重序列比對顯示，Tc-PEBP與豬蛔蟲A.suum、秀麗隱桿線蟲C.elegans、貝拉中桿線蟲M.belari、異尖線蟲A.simplex等均具有保守的PBP結構域，但N，C末端的保守性較差，這可能與不同物種與小分子物質結合有關[25]．PEBP可通過與膜結合對脂質進行轉運[26]，而T.canis中PEBP的結構和功能預測顯示Tc-PEBP在脂質運輸中具有一定的作用，這為今后Tc-PEBP的功能研究奠定了基礎．

磷脂酰乙醇胺結合蛋白在寄生蟲的生長、繁殖和胚胎發育過程中發揮著重要作用．在秀麗隱桿線蟲中PEBP存在于蟲體的肌肉、體壁、陰道等部位，推測其參與早期蟲體的生長發育及外陰形態的發生[27]．在曼氏血吸蟲中，磷脂酰乙醇胺結合蛋白分布于雌蟲子宮、卵巢、輸卵管等部位，表明其與蟲體的發育繁殖有關[28]；在豬蛔蟲體內，磷脂酰乙醇胺結合蛋白存在于雌蟲的子宮、卵巢等生殖組織中，參與維持胚胎的穩態發育[29-31]．在本試驗中，qRT-PCR結果顯示雌蟲體內Tc-pebp在卵巢中高量表達，說明Tc-pebp參與了T.canis雌蟲的繁殖過程．此外，在T.canis雌、雄蟲腸道中均檢測到Tc-pebp的表達．Gobert等[32]在日本血吸蟲體內發現磷脂酰乙醇胺結合蛋白也存在于成蟲腸道中，主要起攝取、運輸宿主體內脂質的作用，而Tc-pebp是否參與對蟲體脂質的攝取、運輸過程，有待后續進一步研究．