靶向HDGF-siRNA轉染對小鼠結直腸癌肝轉移的影響

楊榮嬌 廖劍敏

【摘要】 目的：探討肝癌衍生生長因子（HDGF）的小分子干擾RNA（siRNA）對BALB/c小鼠結直腸癌肝轉移的影響。方法：選擇78只SPF級BALB/c雄性小鼠，應用盲腸造疝原位接種瘤塊法建立小鼠結直腸癌肝轉移模型。將成功建模的小鼠隨機分為3組，即HDGF-siRNA組、NS-siRNA組與生理鹽水（NS）組。根據分組情況，分別于腫瘤原位注射HDGF-siRNA、非特異性siRNA（NS-siRNA）及生理鹽水，劑量均為0.15 ng/kg，連續治療30 d。分時間點記錄各組小鼠體質量的變化。治療結束3 d后處死小鼠，肉眼及肝臟切片蘇木素-伊紅（HE）染色觀察各組結直腸癌肝轉移情況。結果：治療5、10、15、20、25和30 d后，HDGF-siRNA組的體質量均明顯高于NS-siRNA組與NS組，NS-siRNA組的體質量均明顯高于NS組（P<0.05）。HDGF-siRNA組的肝轉移結節數明顯少于NS-siRNA組及NS組，肝轉移率明顯低于NS-siRNA組及NS組（P<0.05）。NS-siRNA組的肝轉移結節數明顯少于NS組（P<0.05），NS-siRNA組與NS組的肝轉移率比較，差異無統計學意義（P>0.05）。結論：HDGF-siRNA可靶向抑制HDGF，從而降低小鼠結直腸癌肝轉移的發生，HDGF在結直腸癌肝轉移中可能起了重要作用。

【關鍵詞】 肝癌衍生生長因子 小分子干擾RNA 結直腸癌肝轉移 HDGF-siRNA BALB/c小鼠

Effect of Targeting HDGF-siRNA Transfection on Liver Metastasis of Colorectal Cancer in Mice/YANG Rongjiao， LIAO Jianmin. //Medical Innovation of China， 2022， 19（02）： 0-031

[Abstract] Objective： To investigate the effect of small interfering RNA （siRNA） of hepatoma-derived growth factor （HDGF） on liver metastasis of colorectal carcinoma in BALB/c mice. Method： A total of 78 SPF BALB/c

male mice were used to establish the model of hepatic metastasis of colorectal cancer. The tumor-bearing mice were randomly divided into three groups， namely HDGF-siRNA group， NS-siRNA group and normal saline （NS） group. According to the grouping， HDGF-siRNA， normal saline nonspecific siRNA （NS-siRNA） and normal saline were injected into the tumor in situ at the dose of 0.15 ng/kg for 30 d. The changes of body weight of each group were recorded at time points. The mice were killed 3 d after treatment. The liver metastasis of colorectal cancer in each group was observed by naked eye and hematoxylin-eosin （HE） staining. Result： After treatment for 5， 10， 15， 20， 25 and 30 d， the body weights of HDGF-siRNA group were significantly higher than those of NS-siRNA group and NS group （P<0.05）. The number of liver metastasis nodules in HDGF-siRNA group was significantly less than those in NS-siRNA group and NS group， and the liver metastasis rate was significantly less than those in NS-siRNA group and NS group （P<0.05）. The number of hepatic metastatic nodules in NS-siRNA group was significantly less than that in NS group （P<0.05）， there was no significant difference in liver metastasis rate between NS-siRNA group and NS group （P>0.05）. Conclusion： HDGF-siRNA can inhibit HDGF and reduce the occurrence of liver metastasis of colorectal cancer in mice， HDGF-siRNA may play an important role in liver metastasis of colorectal cancer.

[Key words] Liver cancer derived growth factor Small interfering RNA Liver metastasis of colorectal cancer HDGF-siRNA BALB/c mice

First-author’s address： The People’s Hospital of Qingyuan City， Guangdong Province， Qingyuan 511518， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2022.02.007

隨著我國人們膳食結構改變及老齡化形勢日益加重，結直腸癌的發病率和死亡率越來越高[1]。同時，結直腸癌患者較易發生肝臟侵襲，而肝轉移也是結直腸癌患者的主要死亡原因[2-3]。雖然，近年來結直腸癌肝轉移臨床治療技術均有較大提升，如手術、放化療等，但臨床效果不太理想，患者預后差[4]。RNA干擾技術是快速高效關閉基因的分子生物學方法，可使目的基因表達被有效阻斷。研究顯示，肝癌衍生生長因子（HDGF）可通過誘導血管內皮生長因子（VEGF）產生，促進血管生成和腫瘤生長[5-6]，與胃癌、膽囊癌、胰腺癌、食管癌、腎癌、肺癌等多種惡性腫瘤的生長進展相關[7-12]。本研究擬以HDGF為靶點，在體內結直腸癌肝轉移動物模型基礎上，探討靶向HDGF-siRNA轉染對小鼠結直腸癌肝轉移的影響。

1 材料與方法

1.1 基因序列的設計 通過進入National center for biotechnology數據庫中，找到HDGF cDNA的全長堿基序列，利用廣州道森生物科技有限公司的“siRNA Target Finder and Design Tools”軟件設計HDGF-siRNA序列，最終設計出3條針對HDGF-siRNA正反義鏈序列：（1）siRNA1，CAACAAAUACCAAGUCUUU dTdT，dTdT GUUGUUUAUGGUUCAGAAA;（2）siRNA2，CAAGGAGAAGAACGAGAAA dTdT，dTdT GUUCCUCUUCUUGCUCUUU;（3）siRNA3，CUACCAAGGAAGAUGCUGA dTdT，dTdT GAUGGUUCCUUCUACGACU）。陰性對照siRNA（NS-siRNA）自行設計，以上設計好后均交由廣州道森生物科技有限公司合成。

1.2 小鼠結直腸癌肝轉移模型的建

1.2.1 實驗動物 選擇78只SPF級BALB/c小鼠[購自廣東省醫學實驗動物中心，生產許可編號：SXCK（粵）2018-0002]，周齡為6～8周，均為雄性，體質量為17～22 g。飼養條件：自然采光，溫度和為濕度分別調節為18～25 ℃和60%～70%，喂養給予普通飼料和自由飲水。

1.2.2 CT26細胞懸液的制備 將小鼠結腸腺癌細胞（CT26細胞）置于RPMI-1640培養液（含10%胎牛血清）中，培養條件為5%CO2細胞培養箱和37 ℃，應用0.25%胰蛋白酶消化法對指數生長期的細胞進行處理，并經機械吹打，制成細胞懸液，并離心5 min（轉速1 000 r/min），棄去上清液，加入生理鹽水配制成濃度為1×106/mL，應用臺盼藍染色法檢測細胞活力>95%。

1.2.3 實體瘤的獲得 隨機抓取2只小鼠，于項背部皮下注射0.4 mL的CT26細胞懸液，10 d后可見有腫塊（直徑約1 cm）形成，對其進行組織取樣，經病理檢查確診為癌組織。

1.2.4 盲腸造疝原位接種瘤塊術 對小鼠進行全身麻醉，使用50 mg/mL的舒泰50進行肌肉注射，劑量為0.01 mL/10 g。然后取仰臥位，固定其四肢，對腹部術野使用75%酒精進行消毒，對左下腹皮膚做直徑約2 cm的縱向切口，稍微游離切口右側皮膚及皮下組織，進腹，將盲腸拖出體外，并刮破其拖出段的中央位置的漿膜，再將瘤塊（直徑約2 mm）置入漿膜刮破處，采取荷包縫合包埋術，再將盲腸拖出段埋回腹腔，并進行腹壁縫合[13-14]。術后小鼠在SPF條件下飼養。

1.3 動物模型分組與治療 成功建模后，隨機將78只小鼠分為3組，各26只，分別為HDGF-siRNA組、NS-siRNA組與NS組，于腫瘤原位分別注射靶向HDGF-siRNA、非特異性siRNA（NS-siRNA）及生理鹽水（NS），劑量均為0.15 ng/kg，每周2次，連續治療30 d。治療結束3 d后，對小鼠進行CO2吸入法處死。

1.4 觀察指標 成功建模后，分別于治療前及治療1、5、10、15、20、25、30 d后記錄小鼠的體質量。對小鼠進行剖腹手術，摘取肝臟，并稱重標記大小。（1）光鏡觀察：使用10%甲醛對肝臟組織進行固定，石蠟包埋，切片（4 μm），行蘇木素-伊紅（HE）染色，并行光鏡下觀察。（2）顯微鏡觀察：取相距為2 mm的肝臟冠狀切面組織共5個，以最大冠狀切面為中心，并行顯微鏡下觀察，統計肝轉移結節數。肝轉移結節數=肉眼下計數+顯微鏡下計數。若同一肝轉移結節在不同切面出現應視為1個肝轉移結節。以肉眼及顯微鏡下未見轉移結節的視為無肝轉移發生，反之出現肝轉移，比較各組轉移率。

1.5 統計學處理 采用SPSS 19.0軟件，計量數據以（x±s）表示，三組間比較行F檢驗，計數數據以率（%）表示，比較行字2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組肝轉移模型小鼠體質量變化比較 治療前和治療1 d后，三組體質量比較，差異無統計學意義（P>0.05）;治療5、10、15、20、25和30 d后，HDGF-siRNA組的體質量均明顯高于NS-siRNA組與NS組，NS-siRNA組的體質量均明顯高于NS組（P<0.05）。見表1。

2.2 肉眼觀察各組小鼠結直腸癌肝轉移情況 肉眼觀察，HDGF-siRNA組可見肝臟質軟，呈紅褐色，形態相對正常，表面光滑，可見少量轉移結節，NS-siRNA組和NS組均可見肝臟解剖結構異常，呈暗紅色，表面可見較多轉移結節。見圖1、2、3。HDGF-siRNA組、NS-siRNA組和NS組肝轉移結節數分別為（1.67±0.52）、（4.17±0.98）、（10.50±1.28）個，HDGF-siRNA組肝轉移結節數明顯少于NS-siRNA組及NS組（P<0.05），而NS-siRNA組肝轉移結節數明顯少于NS組（P<0.05）。

2.3 肝臟切片HE染色觀察各組結直腸癌肝轉移情況 肝臟組織切片在光鏡下可見腫瘤細胞呈現巢狀聚集，異型性大，分化程度差，并且發生細胞核固縮、核碎裂及小片狀壞死，則為肝轉移。在光鏡下，HDGF-siRNA組有2例發生肝轉移，肝轉移率為7.69%。見圖4。NS-siRNA組有14例發生肝轉移，肝轉移率為53.85%。見圖5。NS組有19例發生肝轉移，肝轉移率為73.08%。見圖6。HDGF-siRNA組的肝轉移率明顯低于NS-siRNA組及NS組（字2=13.000、23.084，P<0.05），NS-siRNA組的結直腸癌肝轉移率與NS組比較，差異無統計學意義（字2=2.073，P>0.05）。

3 討論

結直腸癌為臨床上常見的一種消化系統惡性腫瘤，呈逐年上升趨勢。2015年我國結直腸癌新發病例數為38.8萬人，在全部惡性腫瘤中位居第3位[4];結直腸癌死亡患者18.7萬人，死亡率居第5位[3]。因早期結直腸癌缺乏典型臨床癥狀，絕大多數患者診斷時已處于中晚期，且已出現轉移，其中最常見的為肝轉移。

HDGF為肝癌衍生生長因子，近年來大量研究證實其在多種腫瘤組織中表達上調，并參與基因轉錄調控、細胞凋亡、生長、分化和遷移等生物學過程，與腫瘤復發及轉移的臨床病理學特征顯著相關。文獻[15-16]研究發現，HDGF-siRNA不僅有效阻斷HDGF在結直腸癌lovo細胞的表達，而且明顯抑制其增殖，從而在體外可有效誘導結直腸癌細胞凋亡。劉展等[17]研究發現，慢病毒RNAi載體可使HDGF表達明顯下調，有效抑制體外結直腸癌細胞增殖。周南翔[18]和周艷艷等[19]研究顯示，HDGF在肝癌組織和HepG2細胞中高表達，是肝癌獨立的預后預測因子，而siRNA可對其表達進行靶向抑制，從而影響肝癌細胞功能、增殖和侵襲力，而HDGF可能會成為良好的結直腸癌基因治療分子靶點。郭忠聰等[20]研究顯示，抗癌防移片可能通過抑制結直腸癌肝轉移模型BALB/c小鼠HDGF和血管內皮生長因子表達，抑制血管新生，從而抑制結直腸癌肝轉移。

本研究結果發現，治療1 d后，三組小鼠萎靡少動，進食和飲水量減少，體質量均有下降，考慮為麻醉及手術刺激所致。治療5 d后，HDGF-siRNA組小鼠體質量恢復至術前，至第30天取材前體質量較治療前稍有增加。NS-siRNA組小鼠體質量在治療20 d后漸恢復至治療前。NS組小鼠體質量仍呈進行性下降。治療5、10、15、20、25和30 d后，HDGF-siRNA組的體質量均明顯高于NS-siRNA組與NS組，NS-siRNA組的體質量明顯高于NS組（P<0.05）。且HDGF-siRNA組的肝轉移結節數均明顯少于NS-siRNA組及NS組，肝轉移率明顯低于NS-siRNA組及NS組，NS-siRNA組的肝轉移結節數明顯少于NS組（P<;0.05）。

綜上所述，HDGF-siRNA靶向抑制HDGF可降低小鼠結直腸癌肝轉移的發生，HDGF在腫瘤轉移中可能起了重要作用。本研究結果可能會為治療結直腸癌肝轉移提供一個新的思路和方法，有望以HDGF為靶點開發新藥物用于結直腸癌肝轉移的防治。

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（收稿日期：2021-11-25） （本文編輯：占匯娟）