日本結縷草ZjHY5的克隆、亞細胞定位及轉錄自激活檢測

馬 媛， 楊卓雄， 董 笛， 李舒文， 晁躍輝， 許立新

(北京林業大學草業與草原學院， 北京 100083)

光作為重要環境因子之一通過光受體顯著的影響植物種子萌發、幼苗脫黃化、器官發育、開花和種子發育等發育過程，植物的生長和繁殖取決于植物光合作用所獲得的能量[1]。光質、光強以及光照時間的差異都能對植物的光形態建成造成影響[2]。為了感知環境中的光刺激，植物發展出了復雜的分子調控網絡。不同的光感受器可以通過對核心信號網絡的調節，進一步協調特定的激素和代謝信號通路來調節植物的生長和發育[3]。植物萌發過程中，幼苗的子葉封閉，抑制根的生長，并增強下胚軸的伸長來推動莖分生組織向上生長，從而突破土壤表層，引發光形態建成及暗適應(Dark-adapted)向光適應(Light-adapted)的轉變[4]。植物在生命周期中經歷光環境的轉變時(即植物由暗適應向光適應的轉變過程中)，光傳感網絡中的轉錄因子在下游轉錄反應中起著重要作用[5]。光感受器可接受光環境的轉變信號，并激活bZIP，bHLH，MYB，Zinc-finger，GATA等多種中介轉錄因子。這些中介轉錄因子與光響應元件(LREs，Light responsive elements)結合調節轉錄[6]。擬南芥(Arabidopsisthaliana)中堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)轉錄因子家族基因LONGHYPOCOTYL5(HY5)在光誘導基因表達中起中心調控因子的作用[7]。擬南芥hy5突變體在光下不能進行從暗適應到光適應的過渡[8]。從暗適應過渡到光適應的一個普遍特征是某些器官(如下胚軸)的細胞擴張受到抑制，而另一些器官的細胞擴張增加，以及莖和根的分生組織進行持續的細胞分裂而開始生長[5]。擬南芥hy5突變體失去了對下胚軸伸長的抑制，呈現出典型的暗適應生長模式，這表明HY5基因在植物光響應上起到關鍵作用[8]。HY5可以通過調控下游基因的表達來協調光信號及特定基因表達，以響應光信號傳導，從而正向調控植物的光形態建成過程[8]。相較于野生型，hy5突變苗在遠紅光和UV-B光下，下胚軸長度有所增加，同時，HY5也可促進光敏色素、隱色素和UV-B光受體下游的光形態發生[9]。

此外，HY5也是植物生長發育的重要調控因子，它參與細胞伸長、細胞增殖、葉綠體發育、色素積累和營養物質同化等多項發育過程[10]。近年來，HY5在激素、營養、萜烯合成、防御和溫度反應等信號級聯中的作用也逐漸被揭示[6]。

日本結縷草(Zoysiajaponica)主要生長在中國、韓國、日本等東亞國家的溫暖和過渡氣候的地區，是觀賞草坪及運動場草坪中最廣泛使用的多年生暖季型草坪草之一。結縷草耐踐踏、彈性良好、再生力強、病蟲害少且只需較少的維護投入[11-12]。但是，北方地區的日本結縷草生長季節短，綠期短，這成為結縷草利用的主要限制因素[13]。本研究對日本結縷草ZjHY5基因生物信息、亞細胞定位及自激活檢測的研究，可為后續日本結縷草響應光刺激的基礎調控網絡研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用日本結縷草購自Hancock公司，種植于北京林業大學草坪研究所人工氣候箱內，光周期為14/10 h(日/夜)，溫度為26℃，濕度為60%。大腸桿菌感受態DH5α，DNA Maker DL2000PlusⅡ購自北京全式金公司。無縫連接酶購自碧云天生物公司。GoldStar Best MasterMix從北京康為世紀生物公司購買。pMD18-T克隆載體，反轉錄試劑盒、限制性內切酶NcoI、限制性內切酶EcoRⅠ、酵母缺素培養基、酵母轉化試劑盒、PrimeSTAR MAX Premix、金擔子素(Aureobasidin A)和X-α-Gal等均購自Takara公司。RNA提取試劑盒、純化試劑盒和質粒DNA提取試劑盒均從OMEGA公司購買。酵母菌株Y2HGold、酵母誘餌表達載體pGBKT7為本課題組保存。其它常規試劑均為國產分析純化。引物合成由睿博生物技術有限公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1引物設計 根據本實驗室測得的日本結縷草轉錄組數據，應用Primer Premier 5軟件設計ZjHY5-F和ZjHY5-R引物，用于擴增ZjHY5基因的全長序列。使用通用引物M13-F和M13-R來完成pMD-18T載體檢測。依據ZjHY5全長序列測序結果和載體pGBKT7序列設計pGBKT7-ZjHY5-F和pGBKT7-ZjHY5-R載體連接引物，用于構建酵母表達載體，并應用通用引物T7和3-BD來進行檢測。Y3-ZjHY5-F(GGGGACTCTTGACCATGGTAGCTTTTCTTCCCCCTTGCGG)及Y3-ZJHY5-R(ACACGCGTACTAGTCAGATC-GCTCTTGGTGAAGTGGTGCT)用于亞細胞定位載體的構建。應用通用引物Y3-F(GGGGACTCTTGACCATGGTA)及Y3-R(ACACGCGTACTAGTCAGATC)進行檢測。

表1 引物序列Table 1 Sequence of primers

1.2.2ZjHY5基因克隆 選取生長12周新鮮健康的日本結縷草株系，將其葉片摘下并剪碎放入研缽中，加入液氮進行研磨。按照RNA提取試劑盒說明書來提取RNA。對日本結縷草葉片總RNA進行反轉錄，用合成的cDNA作為模板，以ZjHY5-F和ZjHY5-R為引物，用2×GoldStar Taq MasterMix擴增ZjHY5基因片段。PCR反應程序：95℃預變性10 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環；72℃5 min；12℃保溫。PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將符合長度預期的片段進行純化，純化后的產物與pMD-18T載體連接，然后轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，于37℃下進行卡那霉素抗性篩選培養，挑取菌落，應用通用引物M13-F及M13-R進行PCR檢測，程序為：95℃預變性10 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，30個循環；72℃5 min；12℃保溫。將檢測長度符合大腸桿菌菌落送至生物技術公司進行測序，將測序結果進行比對確保擴增正確的目的基因。

1.2.3生物信息學分析 ZjHY5蛋白保守結構域通過NCBI網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)來進行分析。通過SOPMA (https://prabi.ibcp.fr/htm/site/web/home)對ZjHY5蛋白一級、二級、三級結構進行預測，利用ExPASy數據庫(http://expasy.org/)對ZjHY5蛋白各級結構的特性進行分析。Cell-PLoc 2.0網站(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)用于預測ZjHY5蛋白在細胞內的定位情況。目的基因ZjHY5信號肽的預測用SignalP4.1Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)來完成。

1.2.4pGBKT7-ZjHY5誘餌表達載體構建 將測序結果符合預期的大腸桿菌菌液進行質粒提取并以其為模板，使用引物pGBKT7-ZjHY5-F和pGBKT7-ZjHY5-R進行PCR擴增來用于誘餌表達載體的構建。利用限制性內切酶NcoⅠ將載體pGBKT7在37℃條件下酶切處理15 min，通過In-Fusion連接酶將純化后的擴增產物和酶切產物在50℃下連接15 min。然后將其轉化至大腸桿菌DH5α，轉化后涂在LB培養基上進行卡那霉素篩選培養。挑菌后進行菌落PCR檢測，經過凝膠電泳檢測選取片段大小合適的大腸桿菌菌液送至生物公司測序驗證。

1.2.5Y2HGold酵母感受態細胞轉化及自激活作用檢測 將符合測序結果的大腸桿菌菌液大量富集并提取質粒，得到重組質粒pGBKT7-ZjHY5。應用醋酸鋰法制備Y2HGold感受態酵母細胞，并將重組質粒pGBKT7-ZjHY5轉入其中[12]。將轉化得到的酵母菌均勻地涂在SD/-Trp培養基上培養，2～3 d后將培養基上的菌落進行PCR擴增以檢驗酵母重組質粒pGBKT7-ZjHY5是否成功轉化至Y2HGold細胞。將上述成功轉化的菌液分別稀釋10倍、100倍、1 000倍后接種在缺失培養基SD/-Trp，SD/-Trp/X-α-Gal和SD/-Trp/X-α-Gal/AbA中，于30℃下倒置培養3～4 d后，觀察其生長狀態并記錄[12]。

1.2.6亞細胞定位 使用引物Y3-ZjHY5-F和Y3-ZjHY5-R進行PCR擴增，并應用EcoR Ⅰ對Y3載體進行單酶切，用于亞細胞定位載體的構建，并將其轉化到制備好的EHA105農桿菌感受態中，準備生長健康的本生煙草(Nicotianatabacum)葉片并完成注射，然后將其置于黑暗條件下培養2 d。通過使用共聚焦顯微鏡(Leica，SP-8)來觀察信號在細胞中的分布情況。

2 結果與分析

2.1 ZjHY5的克隆及保守結構域分析

應用日本結縷草cDNA為模板，進行PCR擴增，ZjHY5基因開放閱讀框為711 bp，編碼236個氨基酸殘基(圖1，圖2)。保守結構域分析顯示，ZjHY5蛋白屬于bZIP超家族(圖3)。ZjHY5內存在bZIP-HY5-like保守結構域。在調節一系列不同細胞的過程中，bZIP因子在同源及異源二聚體的網絡中發揮作用。bZIP結構基序包含一個基本區域和一個亮氨酸拉鏈。α-螺旋和亮氨酸殘基分開的7個氨基酸，與一個平行的亮氨酸拉鏈結構域形成穩定二聚體。

圖1 日本結縷草ZjHY5基因的克隆Fig.1 Cloning of ZjHY5 gene from Zoysia japonica

圖2 日本結縷草ZjHY5 基因的cDNA序列及蛋白質序列Fig.2 cDNA sequence and protein sequence of ZjHY5 gene from Zoysia japonica

圖3 日本結縷草ZjHY5 的保守結構域Fig.3 The conserved domain of ZjHY5 from Zoysia japonica

2.2 ZjHY5蛋白特性

ZjHY5蛋白由236個氨基酸構成，分子式為C1076H1771N345O368S3，蛋白分子質量為25.525 1 kD，理論等電點為8.89。其負電荷殘基數量為37，正電荷殘基數量為40；不穩定指數為 55.00，經預測，其蛋白性質不穩定。二級(圖4)及三級結構預測(圖5)結果顯示，ZjHY5蛋白主要由α螺旋及無規則卷曲構成，其各占二級結構總比例的47.46%和41.53%，其余結構(包括延伸鏈及β轉角)僅占總比例的11.01%。信號肽預測(圖6)結果顯示，ZjHY5蛋白有信號肽的概率為1.327%。利用MEGA 5.0 軟件對ZjHY5與HY5同源蛋白進行比對并繪制系統進化樹，進化樹顯示日本結縷草中的HY5蛋白與漆姑草(Saginajaponica)及苜蓿(Medicagosativa)中HY5蛋白氨基酸相似度最高(圖7)。

圖4 日本結縷草ZjHY5蛋白的二級結構預測Fig.4 Secondary structure prediction of ZjHY5 protein from Zoysia japonica

圖5 日本結縷草ZjHY5蛋白的三級結構預測Fig.5 Tertiary structure prediction of ZjHY5 protein from Zoysia japonica

圖6 日本結縷草ZjHY5信號肽預測Fig.6 Prediction of ZjHY5 signal peptide from Zoysia japonica

圖7 日本結縷草ZjHY5蛋白的遺傳進化樹分析Fig.7 Phylogenetic analysis of ZjHY5 protein from Zoysia japonica注:DlHY5表示QRV61374.1 龍眼(Dimocarpus longan)HY5-like，MdHY5表示NP 001280752.1 蘋果(Malus domestica)HY5，BrHY5表示XP 009121971.1 蕪菁(Brassica rapa)HY5-like，GrHY5表示AIC64080.1 滇龍膽草(Gentiana rigescenss)HY5，SlHY5表示NP 001234820.1 番茄(Solanum lycopersicum)HY5，AtHY5表示BAA21327.1 擬南芥(Arabidopsis thaliana)HY5，VvHY5表示AGX85877.1 葡萄(Vitis vinifera)HY5，MtHY5表示XP_003622910.1 苜蓿(Medicago truncatula)HY5-like，CqHY5表示QEM23328.1 南漆姑草(Colobanthus quitensis)HY5-likeNote:DlHY5 stands for QRV61374.1 Dimocarpus longan HY5-like,MdHY5 stands for NP 001280752.1 Malus domestica HY5,BrHY5 stands for XP 009121971.1 Brassica rapa HY5-like,GrHY5 stands for AIC64080.1 Gentiana rigescenss HY5,SlHY5 stands for NP 001234820.1 Solanum lycopersicum HY5,AtHY5 stands for BAA21327.1 Arabidopsis thaliana HY5,VvHY5 stands for AGX85877.1 Vitis vinifera HY5,MtHY5 stands for XP_003622910.1 Medicago truncatula HY5-like,CqHY5 stands for QEM23328.1 Colobanthus quitensis HY5-like

2.3 亞細胞定位

亞細胞定位預測結果顯示ZjHY5蛋白定位于細胞核中，為了進一步驗證ZjHY5在細胞中的定位情況，進行煙草的亞細胞定位試驗。將成功轉化35S-ZjHY5-YFP以及35S-YFP載體的農桿菌進行煙草注射，并在共聚焦顯微鏡下觀察熒光蛋白分布情況，預測結果顯示，ZjHY5蛋白定位于細胞核(圖8A,圖8B,圖8C)。

圖8 ZjHY5亞細胞定位Fig.8 Subcellular localization of ZjHY5注：A,D為激發光下35S-ZjHY5-YFP；B,E為融合場；C,F為葉綠體自發熒光Note:A,D stand for ultraviolet field 35S-ZjHY5-YFP fluorescence；B,E stand for merged；C,F stand for chloroplast autofluorescence

2.4 酵母自激活檢測

將成功轉化pGBKT7-ZjHY5誘餌表達載體的酵母菌株經過稀釋后，涂布于3種缺陷固體培養基SD/-Trp，SD/-Trp/X-a-Gal，SD/-Trp/X-a-Gal/AbA上培養2～3 d，并對其生長情況進行觀察。結果表明，SD/-Trp單缺培養基有酵母菌落正常生長，SD/-Trp/X-a-Gal培養基上有酵母菌落正常生長但沒有顯示藍色，轉入pGBKT7-ZjHY5的酵母菌株在SD/-Trp/X-a-Gal/AbA培養基上未見生長且無顏色變化(圖9)。因此構建成功的pGBKT7-ZjHY5誘餌表達載體不能激活酵母菌株營養缺陷型報告基因的表達，可用于后續酵母雙雜交系統進行的蛋白篩選。

圖9 pGBKT7-ZjHY5酵母轉化轉錄自激活檢測Fig.9 Autonomous transcriptional activation of PGBKT7-ZjHY5

3 討論

ZjHY5基因屬于bZIP超家族中的一員。bZIP超家族是最大、最保守的轉錄因子家族之一，其廣泛分布于各個真核生物基因組中并參與光形態建成和光信號傳導，種子成熟及種子萌發等生物學過程[14]。ZjHY5蛋白二級結構的主要形式為α螺旋和無規則卷曲，兩者共約占二級結構總比例的90%。信號肽預測發現，ZjHY5蛋白有信號肽的概率為1.327%，預測結果顯示ZjHY5蛋白無信號肽。進化樹構建結果顯示，ZjHY5蛋白與漆姑草(Saginajaponica)及苜蓿(Medicagosativa)中HY5蛋白的親緣關系最近。HY5轉錄因子已經被證實是光形態建成的正向調控因子，參與植物光、激素及應激信號的應激反應[15-16]。有研究者認為，光受體靶向轉錄因子HY5可能是一種潛在的莖到根信號轉換器，HY5在子葉中經過光合作用介導的誘導，可以從莖運輸到根，可能通過韌皮部，然后在根中激活硝酸鹽轉運體[17]。HY5具有向根系傳播光環境信息的潛在功能[18]。HY5作為下胚軸伸長、花青素和葉綠素積累的調節因子，受到組成型光形態建成1(Constitutively photomorphogenic 1，COP1)介導，整合大量的內外信號通路，在光誘導的光形態建成中發揮最突出的作用[19]。HY5受COP1泛素連接酶調控[19]。在黑暗條件下，PhyB部分失活，光形態形成因子的活性受到抑制，光敏色素互作因子(Phytochrome-interacting factors，PIFs)的穩定性提高，COP1與轉錄因子HY5相互作用，通過破壞它們與各自的光響應啟動子元件(以LRE1為例)的接觸，改變它們的活性構象從而使它們喪失轉錄活性(圖10A)。細胞核內，COP1酶以HY5為靶點，在黑暗環境中介導HY5蛋白降解，從而抑制光形態建成(圖10B)，HY5蛋白在細胞核內行使調控功能，這同亞細胞定位結果相似。亞細胞定位結果顯示ZjHY5蛋白定位于細胞核中。在光照情況下，紅光通過光受體PhyB抑制COP1來增強bHLH轉錄因子家族MYC蛋白的穩定性[20]。MYC轉錄因子是光形態形成的調控因子和PhyB的靶標，可以增強HY5的活性，從而促進光形態發生[21]。試驗結果表明ZjHY5無自激活活性，可用于后期蛋白互作試驗以探究日本結縷草ZjHY5基因在光誘導基因表達中的調控作用。

圖10 COP1-HY5調控模式模型[19，21]Fig. 10 COP1-HY5 module regulatory model

4 結論

本試驗成功克隆日本結縷草ZjHY5基因。ZjHY5基因開放閱讀框為711 bp，編碼236個氨基酸殘基。預測結果顯示該基因ZjHY5蛋白無信號肽，進化樹構建結果顯示，ZjHY5蛋白與漆姑草及苜蓿中HY5蛋白的親緣關系最近。亞細胞定位結果顯示，ZjHY5定位于細胞核中。本試驗成功構建了pGBKT7-ZjHY5酵母誘餌載體，通過對比不同培養基上的酵母單菌落生長情況，發現ZjHY5基因無自激活活性，可用于后續酵母雙雜交試驗篩選與ZjHY5編碼蛋白相互作用的相關蛋白，為研究ZjHY5基因的作用機制奠定基礎。