長鏈非編碼RNA LNC01309對人肝癌細胞增殖和遷移能力的影響及作用機制

劉紅燕，李婧姣，路澤軍，劉詠真，溫居一,

1 安徽醫科大學 海軍臨床學院，合肥 230032；2 解放軍總醫院第六醫學中心 腫瘤內科，北京 100048

肝細胞癌(以下簡稱肝癌)是全球發病率和病死率均較高的惡性腫瘤。近年來肝癌的診斷和治療取得了較大進展，但晚期肝癌患者預后仍較差。目前肝癌的發病機制尚未完全闡明，深入分析肝癌的發生、發展機制，將有助于發現新的肝癌診斷標志物和治療靶點。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在腫瘤形成過程中的表達機制頗受關注，已被公認參與多種腫瘤的發生、發展及預后，與肝癌亦關系密切[1-2]。

在人類基因組中，參與編碼蛋白質的基因僅占2%，超過98%基因組不編碼蛋白質，其基因轉錄產物被稱為非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)[3]。根據其長度，可將ncRNA分為miRNA、snoRNA、piRNA和lncRNA等[4]。ncRNA中大多數為lncRNA，lncRNA的基因長度往往>200 bp，其開放閱讀框一般短于50～100 bp。根據lncRNA在基因組中與編碼蛋白質基因的相對位置，可將其分成5類，即反義lncRNA、正義lncRNA、雙向lncRNA、基因內lncRNA和基因間lncRNA[5]。隨著二代測序技術的快速發展，成千上萬的lncRNA在脊椎動物和非脊椎動物體內被快速鑒別出來。但是，二代測序技術在實際應用中也存在很多缺陷，如文庫制備過程中PCR擴增很大程度會使后續結果出現誤差，而且盡管已經開發出各種算法來提高測序結果的質量，但其對于組裝一個橫跨整個基因組的長片段仍然是一項挑戰。lncRNA通常長度較長且存在多種剪接形式，單純的RNA-Seq并不能分辨各種異構體，因此第三代測序技術的誕生就顯得尤為重要[6]。

PacBio作為最新一代的測序技術，是由美國Pacific Bioscience開發的單分子實時測序(molecule real time sequencing，SMRT)技術，測序過程無需PCR擴增。其在讀取長度方面遠超于二代測序技術，并且無GC偏好性，能夠大大提升基因組組裝的質量[7]。PacBio在研究轉錄組學方面最大的優勢在于它能夠獲得全長或接近全長的轉錄本，這對可變剪切的鑒定、lncRNA的分析[8-9]以及新基因的發現等研究有著重要意義；且能在原有研究基礎上進行補充甚至發現新的機制。

本研究主要利用PacBio三代測序技術在肝癌組織中鑒定新的lncRNA，并在肝癌細胞中進行功能機制的初步探索。

1 材料與方法

1.1 研究材料 收集2018年2月—2019年6月解放軍總醫院第六醫學中心12例肝癌患者的腫瘤組織和對應的癌旁組織。人肝癌細胞系(Hep G2、SNU-398和Hep 3B)購自北京協和醫學院基礎學院基礎醫學細胞中心；人永生化正常肝細胞(THLE-2)購自上海澤葉生物科技有限公司；RPMI-1640及胎牛血清購自美國Thermo Fisher Scientific公司；Smarter PCR cDNA合成試劑盒購自美國Clontech公司；SYBR Green染料購自日本Takara公司；所有引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司；CNOT4、EIF4G2、HNRNPA1、MBNL1、RBM24、RBM6、SRSF10抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；RBM38、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin和GAPDH抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗均購自英國Abcam公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學公司；Transwell小室購自康寧公司；RNA熒光原位雜交(RNA fluorescence in situ hybridization，RNA FISH)和EdU檢測試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司；靶向lncRNA MIR205HG的siRNA由上海吉瑪制藥技術有限公司設計與合成；pCMV-RBM38購自北京義翹神州生物技術有限公司；pEXP-LNC01309野生型和突變型表達載體由廣州銳博生物科技有限公司構建完成。

1.2 細胞培養與細胞轉染 按照培養基和血清配比為9∶1配置完全培養基；所有細胞均采用RPMI-1640完全培養基培養；5% CO2，37 ℃恒溫培養箱為細胞培養環境。細胞轉染采用Lipofectamine 3000試劑。在6孔板中，接種細胞濃度為1×106/孔，培養基體積2 mL，其中siRNA用量為20 nmol/L/孔，質粒用量為8 μg/孔，共孵育24 h后，進行后續試驗。

1.3 RNA提取 采用Trizol提取組織或細胞中的RNA。按100 mg組織加1 mL Trizol研磨，制備組織懸液；5×106細胞加入1 mL Trizol吹打，收獲細胞懸液；且冰上裂解5～10 min后，按200 μL氯仿﹕1 mL Trizol的比例加入氯仿，混勻液體，靜置15 min。然后4 ℃ 12 000 r/min離心分離RNA，吸取上清液至新的EP管中并棄去沉淀。加入等體積異丙醇，4 ℃靜置10 min，12 000 r/min離心10 min，棄去上清液。加入75%酒精充分洗滌沉淀，離心去除上清液。最后將RNA樣品沉淀置于超凈臺干燥5 min，加入DEPC水溶解，Nanodrop測量總RNA濃度，并置于-80 ℃保存。

1.4 PacBio三代測序 利用Trizol提取組織RNA。根據產品說明書，共使用4 μg混合RNA與Pacbio Sequel系統(Pacific Biosciences，CA，USA)進行全長轉錄序列測序。使用Clontech Smarter PCR cDNA合成試劑盒和Pacific Biosciences的luePippin Size Selection系統(PN100-092-800-03)，根據異構體測序(Iso-Seq)協議制備Iso-Seq文庫。后續測序與分析由北京基石生命科技有限公司完成。

1.5 熒光定量PCR 按照試劑盒說明書使用寡(dT)引物在總體積為20 μL的條件下進行cDNA合成；采用染料法，使用最終體積為25 μL的500 ng cDNA模板進行熒光定量PCR。重復3次試驗，數據采用2-ΔΔCt方法處理，以GAPDH為內參。引物序列如下(5′-3′)，lncRNA MIR205HG：正向引物AGCAGCAGCAGCAAGAGTAA，反向引物GAAAGATTAAGGTTCCCATC；LNC01309：正向引物AGCAGCAGCAGCAAGAGTAACT，反向引物GAAAGATTAAGGTTCCCATC；RBM38：正向引物GCTACGGCTTCGTGACCAT，反向引物GTAAGTCCGCTGGATCAAGGT；GAPDH：正向引物AGAAGGCTGGGGCTCATTTG，反向引物AGGGGCCATCCACAGTCTTC。

1.6 Western Blot 冰上裂解細胞并提取細胞中的總蛋白，BCA法檢測總蛋白濃度，向50 μg蛋白樣品中加入等體積的2×Laemmli上樣緩沖液，總上樣體積為20 μL，進行SDS-PAGE電泳。接著進行恒流(200 mA)轉膜，脫脂奶粉封閉，4 ℃孵一抗過夜。次日進行二抗常溫孵育，二抗孵育完成后加入化學發光液與蛋白條帶反應，凝膠成像儀觀察結果。

1.7 細胞增殖檢測 使用CCK-8和EdU檢測細胞增殖。CCK-8檢測：按照1×104/孔細胞數接種至96孔細胞培養板，待細胞貼壁生長覆蓋率達到50%左右，Lipofectamine 3000轉染細胞并持續培養4 d。分別于不同時間點(0、24、48、72、96 h)棄去培養基，加入無血清培養基配置的10% CCK-8反應液，37 ℃恒溫培養箱培養40 min，酶標儀檢測波長在450 nm處的吸光度值。EdU檢測：細胞接種于96孔板中，經轉染處理24 h。然后將50 μmol/L EdU加入培養孔，37 ℃孵育2 h后，用4%多聚甲醛固定細胞。按照標準程序，anti-EdU工作液和DAPI染色孵育細胞。于熒光顯微鏡(奧林巴斯IX71)下觀察，隨機選取不同視野記錄試驗結果。

1.8 細胞劃痕愈合試驗 將各組Hep G2細胞按1×106/孔接種于6孔板中，置于37 ℃，5% CO2培養箱培養過夜。第2天用10 μL槍頭劃兩條平行線，形成劃痕。使用PBS輕輕漂洗2～3遍，加人無血清培養基。放入37 ℃，5% CO2培養箱繼續培養，分別于0、12 h觀察，拍照。用Image J分析遷移面積并計算遷移率。

1.9 Transwell遷移試驗 將轉染后24 h的各組細胞按照5×104細胞數分別接種于Transwell的上室，下室中加入800 μL含20%胎牛血清的培養基。繼續培養24 h，取出小室，采用PBS清洗3次，甲醇固定15 min，用DAPI染色后在熒光顯微鏡下觀察并隨機選取5個以上視野拍照計數。

1.10 RNA FISH 使用預冷的Triton X-100(0.1%)使細胞膜通透，并用多聚甲醛(4%)處理載玻片。然后用LNC01309探針雜交過夜。SCC緩沖液清洗細胞。采用DAPI染細胞核后，熒光顯微鏡觀察結果。

1.11 蛋白質的穩定性測定 用終濃度100 μg/mL的放線菌酮處理細胞，并在指定時間點(0、2、4 h)收取細胞。從細胞中提取蛋白質并進行蛋白質印跡分析。β-肌動蛋白用作參照。

2 結果

2.1 lncRNA LNC01309在肝癌組織和細胞中的表達 在肝癌和對應的癌旁組織中利用PacBio測序分析發現1條高豐度且未見報道的lncRNA(圖1a)，長度為309 nt，暫命名為LNC01309。利用熒光定量PCR檢測分析，結果顯示肝癌組織和對應的癌旁組織中LNC01309水平分別為4.225±2.285與1.541±0.530，差異有統計學意義(t=3.618，P=0.004)(圖1b)。將永生化正常肝細胞(THLE-2)和多種肝癌細胞(Hep G2、SNU-398和Hep 3B)中的LNC01309表達情況進行比較，結果顯示，LNC01309在肝癌細胞中的相對含量分別為1.860±0.126、2.313±0.383和3.917±0.393，均明顯高于THLE-2細胞(1.011±0.074)(t值分別為4.231、6.489、14.480，P值分別為0.004、<0.001、<0.001)(圖1c)。

注：a，PacBio測序分析獲得的LNC01309序列；b，利用熒光定量PCR分析LNC01309在肝癌組織與癌旁組織中的表達差異；c，利用熒光定量PCR分析LNC01309在肝癌細胞和正常肝細胞中的表達差異。

2.2 LNC01309與lncRNA MIR205HG的關系分析 利用NCBI BLAST進行序列比對分析，LNC01309定位于1號染色體(209432225-209432545)，與lncRNA MIR205HG存在較高的序列相似性(表1)。lncRNA MIR205HG亦定位于1號染色體(209428820-209432549)，其目前存在5種剪接體，通過序列比對分析，筆者設計了特異的PCR引物用于區分檢測lncRNA MIR205HG和LNC01309(圖2a)。結果顯示，lncRNA MIR205HG無論是在肝癌組織還是在肝癌細胞中均不存在異常表達現象(圖2b、c)。隨后，在Hep 3B肝癌細胞中利用siRNA敲降lncRNA MIR205HG，分為NC siRNA對照組(NC si)和MIR205HG siRNA處理組(MIR205HG si)。熒光定量PCR結果顯示，隨著lncRNA MIR205HG的下調(1.001±0.082 vs 0.281±0.062，t=15.690，P<0.001)(圖2d)，LNC01309并未明顯下降(1.008±0.046 vs 1.075±0.085，t=1.534，P=0.164)(圖2e)。值得注意的是，LNC01309本身序列中并不含有miR-205序列，因此在肝癌細胞中過表達LNC01309，分為質粒對照組(pEXP-control)和過表達組(pEXP-LNC01309)(1.006±0.099 vs 27.350±5.744，t=9.172，P<0.001)并沒有導致miR-205相對含量的變化(0.971±0.083 vs 0.962±0.100，t=0.142，P=0.892)(圖2f、g)。

表1 利用NCBI BLAST比較LNC01309與lncRNA MIR205HG序列相似性

2.3 LNC01309促進肝癌細胞增殖與遷移 筆者嘗試在含有較低豐度LNC01309的Hep G2細胞中過表達LNC01309(1.006±0.099 vs 27.350±5.744，t=9.172，P<0.001)。RNA FISH試驗結果與在線工具Locate-R(http://locate-r.azurewebsites.net/)預測結果相一致，LNC01309主要定位于細胞質中(圖3、4)。隨著LNC01309水平的升高，肝癌細胞的增殖能力(第96小時OD450值：1.885±0.107 vs 2.527±0.234，t=4.330，P=0.012)顯著上調(圖5、6)。同時，劃痕愈合試驗(11.65%±2.40% vs 35.66%±4.90%，t=9.837，P<0.001)(圖7)和Transwell試驗結果(100.00%±3.11% vs 161.00%±35.93%，t=4.399，P=0.005)(圖8)均顯示肝癌細胞遷移能力增強。Western Blot結果顯示，過表達LNC01309會促進上皮間質轉化(EMT)的標志蛋白N-cadherin(0.466±0.067 vs 1.253±0.046，t=5.322，P=0.009)和Vimentin(0.372±0.126 vs 2.638±0.413，t=7.292，P=0.018)的表達，同時下調E-cadherin的表達(0.909±0.032 vs 0.151±0.014，t=50.450，P<0.001)(圖9)。

注：a，LNC01309與lncRNA MIR205HG序列相似性，并根據序列差異性設計特異性檢測引物；b，利用熒光定量PCR分析lncRNA MIR205HG在肝癌組織與癌旁組織的表達差異；c，利用熒光定量PCR分析lncRNA MIR205HG在肝癌細胞和正常肝細胞中的表達差異；d、e，Hep 3B細胞經轉染siRNA(20 nmol/L)處理24 h后，利用熒光定量PCR分別檢測lncRNA MIR205HG和LNC01309的相對表達含量；f、g，Hep G2細胞中轉染過表達質粒24 h后，利用熒光定量PCR分別檢測LNC01309和miR-205的相對表達含量。

圖3 在線工具Locate-R預測LNC01309的細胞定位

注：Hep G2細胞中轉染LNC01309表達質粒以及對照質粒(24孔板中使用量為1 μg/孔)處理，于不同時間點利用CCK-8檢測細胞活性。

圖6 EdU染色試驗檢測轉染LNC01309表達質粒的Hep G2細胞增殖

圖7 細胞劃痕試驗檢測轉染LNC01309表達質粒的Hep G2細胞的遷移能力

圖8 Transwell檢測轉染LNC01309表達質粒的Hep G2細胞的遷移能力

圖9 Western Blot檢測各組細胞中EMT標志蛋白的相對含量

2.4 LNC01309與RNA結合蛋白的相互作用 利用在線工具RBPmap(http://rbpmap.technion.ac.il/index.html)和catRAPID(http://service.tartaglialab.com/page/catrapid_group)分析LNC01309的潛在結合蛋白，獲得了CNOT4、EIF4G2、HNRNPA1、MBNL1、RBM24、RBM38、RBM6和SRSF10共8個排名靠前的候選蛋白(表2)。隨后，在Hep G2細胞中過表達LNC01309，利用候選蛋白的特異抗體進行RNA免疫共沉淀試驗，富集結果分別為0.087±0.044、0.120±0.107、0.192±0.105、0.164±0.093、0.153±0.108、0.502±0.213、0.124±0.085和0.168±0.068；與IgG對照組比較，僅RBM38抗體組差異有統計學意義(0.502±0.213 vs 0.060±0.029，t=3.846，P=0.031)(圖10a)。將RBM38潛在結合位點(gugugcg)

表2 利用RBPmap和catRAPID在線預測能夠與LNC01309結合的潛在靶標蛋白

缺失突變后構建突變型LNC01309。RNA免疫共沉淀實驗結果顯示，與IgG對照組比較，RBM38抗體組沉淀富集的野生型LNC01309相對含量顯著升高(0.434±0.122 vs 0.034±0.017，t=5.123，P=0.036)，而突變型LNC01309在兩組中的沉淀富集豐度差異無統計學意義(0.077±0.051 vs 0.031±0.006，P=0.201)(圖10b)。

注：a，利用潛在RNA結合蛋白的特異性抗體進行RNA-IP試驗，熒光定量PCR檢測LNC01309的富集豐度；b，熒光定量PCR比較RBM38的抗體對野生型和突變型LNC01309的富集豐度差異。

2.5 LNC01309影響RBM38蛋白穩定性 在相對低表達LNC01309的Hep G2細胞中過表達LNC01309時，并不會影響RBM38 mRNA的相對表達量(1.022±0.074 vs 0.953±0.076，P=0.185)，但會降低RBM38蛋白的相對含量(0.960±0.057 vs 0.228±0.044，t=5.526，P=0.008)(圖11)。利用放線菌酮處理Hep G2細胞，LNC01309過表達組細胞中RBM38蛋白的穩定性顯著低于對照質粒組(第4小時相對蛋白含量：0.610±0.075 vs 0.179±0.054，t=8.038，P=0.001)(圖12、13)。此外，過表達的RBM38能夠有效抑制LNC01309的促細胞增殖能力(第96小時OD450值：2.500±0.227 vs 1.913±0.282，t=2.812，P=0.048)(圖14)。細胞劃痕愈合試驗結果(30.69%±5.80% vs 16.37%±1.66%，t=6.218，P<0.001)(圖15)和Transwell試驗結果(168.00%±9.43% vs 117.20%±18.03%，t=6.622，P<0.001)(圖16)均顯示過表達的RBM38能夠有效抑制LNC01309誘導的肝癌細胞遷移能力的上調。

圖11 Western Blot檢測轉染LNC01309表達質粒的Hep G2細胞24 h后RBM38蛋白的相對表達含量

圖12 Western Blot檢測不同時間點經放線菌酮處理轉染LNC01309表達質粒的Hep G2細胞中的RBM38蛋白相對含量

圖13 不同時間點檢測經放線菌酮處理轉染LNC01309表達質粒的Hep G2細胞中RBM38蛋白相對含量

注：Hep G2細胞中單獨轉染pEXP-LNC01309或者共轉染pCMV-RBM38質粒24 h后，于不同時間點利用CCK-8檢測各組細胞活性。

圖15 細胞劃痕愈合試驗檢測各組轉染HepG2細胞的遷移能力

圖16 Transwell檢測各組轉染Hep G2細胞的遷移能力

3 討論

大量的研究[10-12]工作已經證實lncRNA與肝癌的發生、發展及預后密切相關。例如，lncRNA ATB競爭性地結合miR-200，進而激活ZEB1和ZEB2的表達；ZEB1和ZEB2與IL-11 mRNA的相互作用增強了Stat3信號，促進肝癌轉移，加速器官受累[13]。lncRNA HULC在肝癌中異常高表達[14]，能夠介導腫瘤抑制因子P18的下調，可促進肝癌的細胞增殖[15]。lncRNA HOTAIR降低

了CREB、P300、RNApoⅢ在SETD2啟動子區域的重新分配，從而抑制了SETD2的表達和磷酸化，借此促進人類肝癌干細胞的惡性生長[16-17]。目前發現lncRNA主要有以下幾個方面的調控功能[18-19]。(1)表觀遺傳學：通過干擾轉錄因子與啟動子結合、誘導蛋白質修飾和染色質發生重構等方式影響編碼基因表達；(2)轉錄調控：與靶蛋白結合后影響基因轉錄；(3)轉錄后調控：能調控mRNA穩定性和翻譯進程，作用蛋白結合伴侶或調節蛋白的亞細胞定位影響蛋白活性等，進而影響腫瘤進展[20]；(4)編碼微肽：lncRNA重新獲得編碼能力，產生具有功能的微肽[21]。筆者通過PacBio測序分析LNC01309顯示，在肝癌組織和肝癌細胞中均呈現高表達狀態。后續的試驗結果發現LNC01309能夠與RBM38蛋白發生相互作用，并借此下調RBM38蛋白穩定性。

RBM38是一種RNA結合蛋白，在正常細胞中通過調控RNA參與基因轉錄后調控，從而影響細胞增殖、細胞周期循環、肌源性分化等多種生物學過程。目前已知RBM38可與p53、mdm2、p63、p73、p21、c-Myc和MIC-1等多個目的基因的3′非翻譯區結合，調節相應mRNA的穩定性，從而在腫瘤進展中發揮關鍵作用[22-27]。現有研究[28]顯示，RBM38可能通過穩定p53-mdm2環抑制肝癌的發生。p53-mdm2通路在肝癌中經常發生改變，mdm2和p53基因突變可增加mdm2的穩定性，加速p53降解，破壞p53-mdm2平衡，從而誘導癌變，最終促進肝癌發生。Ye等[28]報道RBM38作為穩定p53-mdm2環的重要分子，在肝癌組織中RBM38失活，而mdm2表達增加，野生型p53表達隨之降低，最終破壞p53-mdm2環的平衡；相反，若增加RBM38表達則可抑制肝癌細胞mdm2的表達，恢復野生型p53的表達，從而在體外抑制肝癌細胞遷移和侵襲；裸鼠體內實驗也顯示RBM38對肝癌的體內致瘤性具有一定抑制作用。以上體內外研究結果表明，上調RBM38可能通過抑制mdm2從而拯救野生型p53，進而改變肝癌的生物學功能和進展。本研究結果表明RBM38能夠與野生型LNC01309發生結合作用，而不能夠結合突變型LNC01309。LNC01309通過與RBM38的相互作用降低RBM38的蛋白穩定性，促進肝癌細胞的惡性表型特征。

LNC01309與lncRNA MIR205HG具有較高的序列相似性。然而敲降已知的lncRNA MIR205HG不同剪接體，并不會改變LNC01309的相對含量。這些結果提示，LNC01309并不是已知lncRNA MIR205HG的再加工形式或者降解片段，其可能是MIR205HG基因初始轉錄本的另一種剪接體形式。已知的lncRNA MIR205HG在肝癌組織和肝癌細胞中并不存在異常表達現象，這也是與LNC01309最大的區別。

LNC01309在肝癌細胞中主要定位于細胞質。由于lncRNA通常會作為內源性RNA海綿與miRNA作用并影響miRNA的表達與功能，而lncRNA定位于細胞質是這一功能發揮的前提條件，因此LNC01309理論上存在參與調控miRNA表達與功能的潛質，這也是后續應開展的研究方向。

綜上，本研究團隊依賴于肝癌組織的PacBio測序分析獲得一條全新lncRNA LNC01309，在肝癌細胞中進行了相關功能探索，初步證明LNC01309通過與RBM38相互作用降低了RBM38的蛋白穩定性，促進肝癌細胞的增殖與遷移。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：劉紅燕參與課題設計，完成試驗，文章寫作；李婧姣、路澤軍、劉詠真參與試驗、收集和分析數據及修改文章；溫居一負責研究方案總體規劃設計，指導撰寫文章及論文修改。