神經前體細胞表達發育下調蛋白4-1在胰腺癌組織中的表達和臨床意義

畢亭亭，侯思慧，劉 巖

東南大學附屬徐州市中心醫院 a.消化內科，b.普外科，江蘇 徐州 221009

胰腺癌是一種來源于胰腺腺管上皮細胞，惡性水平非常高的消化道腫瘤。近年來，胰腺癌患病人數逐漸增多，在美國惡性腫瘤致死人數排名中高居第4位[1],在我國居第6位[2]。據報道[3-4]，2020年美國預計有57 600例新發胰腺癌病例，且因胰腺癌死亡的人數達到4705例。預計至2030年，胰腺癌將超過乳腺癌、前列腺癌和結直腸癌，升至惡性腫瘤致死率排名第2位，僅低于肺癌。目前，手術切除仍然是胰腺癌治療的主要手段，但根治術后5年存活率僅15%～25%[5]，且復發和轉移率很高。由于耐藥高發，亦導致化療效果大打折扣[6]。因此，探索胰腺癌發生進展機制，尋找敏感治療靶點尤為重要。神經前體細胞表達發育下調蛋白4-1(neural precursor cell expressed,developmentally down-regulated 4-1，NEDD4-1)在真核生物的細胞核和細胞質內表達，通過調節泛素化的活化水平而發揮多種生物學功效。研究[7-9]發現，NEDD4-1在60%的乳腺癌組織中呈高表達，在80%的非小細胞肺癌患者中呈高表達，在晚期胃癌患者中顯著上調且與腫瘤的遠處轉移、復發等緊密相關。但NEDD4-1在胰腺癌中的表達水平及臨床意義尚未明確，本研究旨在分析NEDD4-1在胰腺癌組織中的表達及與多種臨床病理特點和疾病預后的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2017年1月—2019年12月于徐州市中心醫院行手術治療的58例胰腺癌患者及其中42例對應的胰腺癌旁組織，病理學檢查均確診為胰腺導管腺癌。所有患者術前均未接受過放化療或新型輔助治療。其中，男31例，女27例；≤60歲20例，>60歲38例；高中分化腺癌26例，低分化腺癌32例；淋巴結轉移27例，淋巴結未轉移31例；遠處臟器轉移21例，無遠處轉移37例；參照美國癌癥聯合委員會第八版胰腺癌TNM分期指南[10]，TNMⅠ/Ⅱ期31例，Ⅲ/Ⅳ期27例。

1.2 免疫組化及評分標準 胰腺癌組織標本脫蠟水化，使用DAB顯色及蘇木紫染色方案進行：1∶300抗NEDD4-1抗體一抗孵育過夜，1∶5000二抗反應30 min，最后使用顯微鏡進行觀察評判。染色結果判定：NEDD4-1蛋白陽性染色主要集中在細胞質中。染色強度評分：無染色計0分；微弱染色(表現為淡黃色)計1分；中等染色(表現為棕黃色)計2分；強染色(表現為棕褐色)計3分。陽性染色比例評分：陽性染色細胞占比0～5%計0分；6%～30%計1分；31%～50%計2分；51%～70%計3分；≥71%計4分。染色結果判定總分=染色強度分值×陽性染色比例分值。總分為0分者計為陰性表達；1～2分者計為弱陽性表達；3～6分者計為中陽性表達；>6分者計為強陽性表達。

1.3 Western Blot檢測蛋白表達水平 收集處在對數生長期的正常胰腺導管上皮HPDE6-C7細胞及胰腺癌SW1990、BxPC-3、PANC-1細胞，應用細胞裂解液提取細胞中的蛋白，采用BCA試劑盒進行蛋白含量測定，10% SDS分離膠電泳分離總蛋白后轉移至PVDF膜，封閉處理后分別孵育NEDD4-1及GAPDH一抗，使用二抗孵育后進行顯色。最終取得的條帶采用Image J 軟件進行灰度值分析。

2 結果

2.1 NEDD4-1在胰腺癌組織及細胞內的表達 在58例胰腺癌組織中，28例呈強陽性表達，12例呈中陽性表達，6例呈弱陽性表達，陽性表達率達79.31%；在對應的42例胰腺癌旁組織中，7例呈弱陽性表達，1例呈中陽性表達，34例呈陰性表達，陽性表達率僅為19.05%。與胰腺癌旁組織相比，胰腺癌組織中NEDD4-1的陽性表達率明顯升高(χ2=35.614，P=0.001)(圖1)。Western Blot結果顯示，NEDD4-1在胰腺癌細胞株SW1990 (1.18±0.14)、BxPC-3(1.40±0.21)及PANC-1(1.29±0.15)內的蛋白相對表達水平相較于正常胰腺導管上皮HPDE6-C7(0.61±0.09)細胞明顯上升(t值分別為0.004、0.004、0.003，P值均<0.01)(圖2)。

注：a，陰性表達；b，弱陽性表達；c，中陽性表達，d，強陽性表達。

2.2 NEDD4-1表達與胰腺癌患者臨床病理特征的相關性 胰腺癌組織中NEDD4-1表達水平與胰腺癌遠處轉移、腫瘤分化程度和TNM分期相關(P值均<0.05)(表1)。

表1 胰腺癌組織內NEDD4-1表達水平患者的臨床病理特征比較

2.3 NEDD4-1表達和胰腺癌患者預后的相關性 本研究末次隨訪時間為2020年6月，若患者死亡則隨訪結束。Kaplan-Meier曲線顯示，胰腺癌患者總體生存時間為(15.45±1.00)個月，中位生存時間為(15.00±0.91)個月。NEDD4-1陽性表達患者平均存活(13.61±0.95)個月，中位生存時間為(13.00±0.92)個月；NEDD4-1陰性表達患者平均存活時間可達到(22.22±2.20)個月，中位生存時間為(19.00±5.20)個月。與NEDD4-1陰性表達患者相比，NEDD4-1陽性表達患者平均存活時間明顯短縮(χ2=10.348，P=0.001)(圖3)。

圖3 不同NEDD4-1表達組胰腺癌患者Kaplan-Meier曲線

2.4 影響胰腺癌預后的危險因素分析 單因素Cox分析結果顯示，遠處轉移、TNM分期、NEDD4-1表達、淋巴結轉移和分化程度與胰腺癌的預后相關(P值均<0.05)。多因素Cox分析結果顯示，NEDD4-1表達、分化程度和淋巴結轉移為胰腺癌患者預后的獨立危險因素(P值均<0.05)(表2)。

表2 影響胰腺癌患者預后的Cox比例風險模型分析

3 討論

目前，胰腺癌全球患病率逐年遞增[11]。我國胰腺癌患病人數、死亡率也呈上升趨勢[12]，且這種趨勢將隨著多種因素繼續上升[13]。胰腺癌的早期臨床診斷較難，雖然越來越多的科研人員針對胰腺癌的病理學、診斷學開展積極研究探索，但目前臨床上仍缺乏靈敏度、特異度高的診斷標志物，被廣泛認可的診斷指標仍只有CA19-9[14]。因此，亟需探明胰腺癌的發生發展和預后相關特異性分子標志物，以指導靶向藥物的開發，提升臨床治療水平。

泛素連接酶E3作為泛素-蛋白酶體系統的一個關鍵組成部分，具有調節細胞內的基因轉錄、降解細胞中錯誤表達的蛋白并穩定細胞質的膜蛋白等重要生物學功能，同時還具有抑制惡性腫瘤病程進展的特異性作用[15]。NEDD4家族是目前研究最多、最清楚的一類E3連接酶，且NEDD4-1作為NEDD4家族中重要的成員之一，同樣也具備上述一系列功能。既往NEDD4-1相關研究多關注于細胞膜鈉離子通道狀態的調控和神經細胞發育等方面，如調節細胞的增殖、T淋巴細胞的功能、神經肌肉接頭處的成熟發育、中樞神經系統的生長發育及軸突傳導等[16]。近段時間以來，NEDD4-1在腫瘤發生發展過程中的作用受到越來越多的學界關注[17]。NEDD4-1作為一種原癌基因，被發現在人類多種惡性腫瘤(如結腸癌、肺癌)的組織中呈異常的表達上調，還可作為前列腺癌、乳腺癌預后的獨立預測因子，有望成為一種新的腫瘤治療靶點[18]。Weng等[19]研究發現，NEDD4在胰腺癌細胞株中的表達明顯上調且與細胞的侵襲遷移能力密切相關。然而，目前尚未見有NEDD4-1在人胰腺癌組織中的表達及其與病程發生發展關系的報道。本研究證實了胰腺癌組織中NEDD4-1的表達水平較癌旁組織明顯升高，且胰腺癌細胞株中NEDD4-1的表達相較于正常胰腺導管上皮細胞明顯上調；組織內NEDD4-1表達改變與胰腺癌患者的遠處轉移、腫瘤分化程度及腫瘤TNM 分期緊密相關；NEDD4-1表達升高可影響胰腺癌患者的存活率，且與胰腺癌的不良預后密切相關，其或可作為胰腺癌預后的一個預測因子。

本研究的不足之處在于納入樣本量有限，且病理類型較為單一，希望后續開展多中心、更大樣本量的研究證實相關結論。

綜上所述，NEDD4-1在胰腺癌中高表達，且可能成為評判胰腺癌預后的潛在標志物，進一步探究NEDD4-1可能為揭示胰腺癌病程進展及預后所涉及的相關分子機制提供一定的推進作用，也將為胰腺癌的診治提供一個新的思路。

倫理學聲明：本研究方案于2020年2月20日經由徐州市中心醫院倫理委員會審批通過，批號：2020倫審026號。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：畢亭亭、劉巖負責設計研究思路，論文撰寫；畢亭亭、侯思慧負責收集臨床資料，統計分析；劉巖負責論文最終定稿。