骨形態發生蛋白9在門靜脈性肺動脈高壓中的作用機制

張瑞華，秦婷婷，邵玥明,2，張 雨,1b，溫曉玉

1 吉林大學第一醫院 a.肝膽胰內科，b.小兒內分泌遺傳代謝科，長春 130021； 2 上海市(復旦大學附屬)公共衛生臨床中心 感染與免疫科，上海 201508

肺動脈高壓(pulmonary hypertension，PAH)是由多種病因及發病機制所致的肺血管結構或功能改變，引起肺血管阻力和肺動脈壓力升高的臨床和病理生理綜合征，繼而發展為右心衰竭，甚至死亡。肺部病理學特征是血管壁中內皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞增殖導致小肺動脈狹窄和閉塞[1]，肺血管阻力升高進而導致嚴重PAH。應用現有治療方法后平均無移植3年生存率仍只有60%～70%[2-3]。門靜脈性肺動脈高壓(portopulmonary hypertension，POPH)是在門靜脈高壓(伴或不伴慢性肝病)基礎上出現肺動脈壓力升高。2018年，第六屆世界肺高血壓會議[4]將POPH歸為1類PAH(1類PAH指特發性、遺傳、藥物和毒素誘導、新生兒綜合征、具有肺靜脈閉塞性疾病或肺毛細血管血管瘤病以及與以下內容相關的PAH：結締組織病、門靜脈高壓癥、先天性心臟病、血吸蟲病等)。骨形態發生蛋白9(bone morphogenetic protein 9，BMP9)，也稱為生長分化因子2 (growth differentiation factor 2，GDF2)[5]，其作為內皮細胞保護因子及血管穩態因子，通過其自身及受體和下游效應物參與PAH及POPH發病，現將BMP9信號通路及其在PAH及POPH發病中的作用等方面的研究進展作一總結。2016年國際肝移植學會實踐指南[6]指出：將POPH根據右心導管測定的平均肺動脈壓(mean pulmonary artery pressure，mPAP)進行分級，可分為輕度(25 mmHg≤mPAP<35 mmHg)、中度(35 mmHg≤mPAP<45 mmHg)和重度(mPAP≥45 mmHg)。

1 POPH流行病學及其發病機制

1951年Mantz和Craige[7]發現了第1例POPH。POPH發病率低，不同研究中其發病率不同，在PAH中占5%～10%[8]，在門靜脈高壓患者中占1%～2%[9]，即使在肝移植患者中也僅占2%～6%[10]。

由于POPH發病率低，臨床相關樣本量少及與之相關的動物模型建立困難，其發病機制尚不清楚。目前研究考慮其發病機制主要有以下幾種。(1)晚期肝病患者門靜脈高壓，其高動力循環及外周血管阻力降低，導致肺循環血流增加，肺動脈遭受剪切應力增加，造成肺血管內皮受損，進而原位血栓形成、血管內皮細胞增殖，肺動脈壓力進行性升高[11]。(2)血管活性物質失調：內皮細胞和血管平滑肌細胞對血管緊張度的調節是由平衡的血管擴張劑(如前列環素和一氧化氮)和血管收縮劑[包括內皮素(endothelin，ET)1]介導的。肝臟合成、分解代謝功能受損以及門靜脈高壓引發各種血管功能障礙級聯反應，從而影響肺部血管系統[12]。門靜脈高壓引起的門體分流允許局部產生或積累的血管活性化合物繞過肝臟進入不同的血管。此外，腸道微生物群及其相關的具有強血管活性、內皮靶向性和細胞毒性特性的雙產物的變化可進一步使血管功能障礙復雜化和擴散，從而破壞TGFβ、前列腺素、ET、一氧化氮或血管內皮生長因子信號通路，ET-1、IL-1、IL-6等引起血管收縮物質增加，一氧化氮、前列環素等引起血管舒張物質減少[13]，PAH形成與這種平衡向過度肺血管收縮的轉變有關。(3)氧化應激：POPH患者氧化應激程度升高，抗氧化系統失調[14]。(4)雌激素：性別對PAH發展有影響，根據潛在疾病病理，女性與男性之比約為4∶1[15]。Sehgal等[16]提出物種特異性雌性(“更連續型”)與雄性(“脈動型”)循環生長激素水平的時間模式，解釋了為什么女性比男性更易患PAH；Al-Naamani等[17]研究發現POPH患者尿液中16α羥基雌酮及血漿16α羥基雌二醇升高，其通過促進增殖、促炎及氧化應激等促進肺血管重塑，證實了雌激素信號通路與POPH密切相關。(5)免疫性因素：自身免疫性肝病患者POPH風險增加[18]。(6)遺傳易感性：遺傳性PAH是常染色體顯性疾病，在高危人群中外顯率低(平均20%～30%)。研究[19]發現攜帶骨形態發生蛋白受體(bone morphogenetic protein receptor，BMPR)2突變患者更容易發生PAH，疾病更嚴重，死亡更快。相關研究[20-21]表明，遺傳性PAH患者BMP9及其受體和下游效應物存在功能缺失突變，在此基礎上Nikolic等[22]發現POPH患者血漿BMP9較其他原因的PAH患者明顯減低，當BMP9血漿濃度低于132 pg/mL時，BMP9對識別POPH具有較高敏感度及特異度。因此，BMP9信號通路獲得性缺失可能也參與POPH發病。

2 BMP9結構、生理表達及其作用

BMP屬于TGFβ超家族，首次被發現是在骨和軟骨形成中起重要作用[23]。目前在已知BMP調節早期發育、器官發生和細胞分化的各個方面，作為成熟組織體內平衡的關鍵調節劑發揮更廣泛的作用。目前已知人類有15個BMP配體，其中僅BMP9與BMP10具有高序列相似性。雖然BMP9在2000年首次報道[24]，但直到2007年2項研究[25-26]同時報道BMP9是激活素受體樣激酶(activin receptor-like kinase,ALK)1的高親和力配體，優先作用于血管內皮細胞，抑制血管生成并賦予血管內環境穩定，方才引起人們的廣泛關注。

與其他BMP相似，BMP9合成429個氨基酸的前體(pre-pro-BMP9)，包含22個氨基酸的信號肽，297個氨基酸的前結構域和110個氨基酸的成熟蛋白[5,27]。然后，該前體被絲氨酸內切蛋白酶切割以產生成熟的蛋白質二聚體(25 kD)，該二聚體可以與2個前結構域(每個33 kD)保持非共價結合，形成100 kD的復合物[28](圖1)。當與前結構域復合時，成熟BMP9二聚體仍保持其生物活性[28-29]。結合的前結構域被認為增強了BMP9在體內的穩定性。100 kD循環前BMP9復合物中約有60%被切割并具有活性，而其余40%未加工，可通過局部furin蛋白酶切割而被激活[28]。BMP9表達存在組織特異性，其主要在肝臟[24,30]中被檢測到，在肺[30]和大腦[5,31]中也有較低水平表達。

注：BMP9合成429個氨基酸前體，包含22個信號肽，297個前結構域和110個成熟蛋白，該前體被絲氨酸內切蛋白酶切割產生成熟蛋白質二聚體，該二聚體與兩個前結構域保持非共價結合，形成100 kD復合物。

BMP9具有廣泛的生物學功能，包括葡萄糖穩態與胰島素抵抗、脂肪形成、血管生成、神經發生、腫瘤發生、淋巴管成熟及成骨等作用(圖2)，其中BMP9作為一種血清靜止因子，可抑制內皮細胞增殖和血管形成。Scharpfenecker等[25]研究發現，應用BMP9可有效抑制堿性成纖維生長因子刺激的細胞生長，但對細胞增殖未見影響。同時，研究發現BMP9完全消除血管內皮生長因子誘導的管狀結構形成，表明BMP9是體外血管生成的有力抑制劑。Park等[32]發現人肺動脈血管內皮細胞(human pulmonary artery endothelial cell，HPAEC)中生理濃度BMP9可通過Smad1和p38 MAPK介導顯著刺激ET-1釋放，進而抑制內皮細胞遷移，其中ET-1是由21個氨基酸組成的多肽，是血管收縮劑和有絲分裂原[33]。同時，BMP9可作為內皮細胞保護因子維持內皮完整性。趨化因子(C-C基序)配體2(CCL2)是參與單核巨噬細胞趨化的關鍵趨化因子，Upton等[34]在實驗中發現BMP9依賴ALK1、活化素受體Ⅱa型(Activin receptor-Ⅱa,ACTR-Ⅱa)和骨形態發生蛋白受體Ⅱ型(BMPR-Ⅱ)抑制人肺動脈內皮細胞和主動脈內皮細胞CCL2的基礎表達和釋放。Chen等[35]研究了支氣管肺發育不良和PAH中的BMP9信號傳導，發現BMP9能夠改善異常肺泡發育，還減少了肺部炎癥和血管外膠原沉積，而對正常的新生兒肺部發育未見負面影響。

圖2 BMP9生理作用

3 BMP9/ALK1/BMPR-Ⅱ/Endoglin/Smad信號通路

BMP9/ALK1/BMPR-Ⅱ/Endoglin/Smad信號通路在調節血管形成與穩態維持中發揮著重要作用，ALK1是TGFβ/BMP家族蛋白的Ⅰ型受體，也是肝臟非實質細胞中BMP9的主要受體[36-37]。BMPR-Ⅱ是TGFβ信號傳導途徑的成員，其介導的信號傳導在維持內皮完整性及屏障功能方面至關重要[38]。BMPR2功能缺失突變是PAH最常見的遺傳原因[39]，肺血管BMPR-Ⅱ表達減少是遺傳性和特發性PAH特征[40]。BMPR2突變已在約70 %家族性PAH和高達25 %散發性PAH中得到證實[41]。內皮糖蛋白(Endoglin)也被稱為CD105，是一種跨膜蛋白，具有較大的胞外域和富含絲氨酸/蘇氨酸的胞質區，其不能單獨結合配體，但可以作為輔助受體，在Ⅰ型或Ⅱ型信號傳導受體存在下結合BMP9。已知ALK1或內皮糖蛋白突變是引起遺傳性出血性毛細血管擴張癥的主要遺傳原因，并且在遺傳性出血性毛細血管擴張癥類綜合征患者中也報告了罕見的BMP9變異[42]。Smad蛋白家族包含8種蛋白，可被分為3個亞族：調節性Smad(R-Smad)，共同性Smad(Co-Smad)，抑制性Smad(I-Smad)。其中，Co-Smad可與R-Smad結合轉導信號，而I-Smad下調Smad活化調節受體穩定性從而抑制信號轉導[43]。BMP9是半胱氨酸結同源二聚體生長因子，是作用于內皮細胞的主要BMP配體[26]，其通過與2個Ⅰ型受體(ALK1)和2個Ⅱ型受體(包括BMPR-Ⅱ、ACTR-Ⅱa和/或Ⅱb)形成復合物發揮作用。當BMP9結合后，Ⅱ型受體組成型活性絲氨酸-蘇氨酸激酶結構域磷酸化并激活Ⅰ型受體，激活的I型受體磷酸化下游底物蛋白R-Smad的C端，一旦R-Smad磷酸化便進一步與共同性受體Smad4形成復合物，最終轉移至細胞核內進而調節靶基因的轉錄。

4 BMP9信號通路參與PAH及POPH發病的作用機制

因POPH與其他形式PAH之間組織病理學相似，故POPH發病機制多來源于對PAH的研究。基于BMP9保護內皮細胞和維持血管穩態的作用，國內外研究人員針對BMP9信號通路及其與PAH乃至POPH的相關性進行了一系列研究工作(圖3)。2016年，Wang等[44]報道了1例罕見BMP9純合無義突變，突變中第26位氨基酸從谷氨酰胺轉變為終止子，BMP9過早截斷導致功能喪失，研究者認為正是這種BMP9功能喪失，降低了BMPR-Ⅱ及ALK1的表達，并破壞了其與內皮糖蛋白的相互作用，從而導致PAH發病，其中無義突變的純合性解釋了該患者為何早期發病及發病的嚴重程度。GDF2基因編碼BMP9，Hodgson等[45]通過對一個歐洲PAH患者隊列進行功能分析發現了GDF2基因罕見破壞性突變，大多數突變導致成熟蛋白質的細胞加工改變和分泌減少，進而導致BMP9循環水平及活性降低。這些發現支持了突變在PAH病理生物學中的因果作用，并為人類BMP9水平和活性降低促進PAH發展提供了有力的證據。

圖3 BMP9在PAH肺血管重塑中作用

然而，在特發性PAH中BMP9扮演什么樣的角色仍然存在分歧。ET-1作為血管收縮劑和有絲分裂原，其已被證明可調節內皮細胞遷移和血管生成，Star等[46]通過體外研究指出，PAH時BMP9刺激人肺微血管內皮細胞釋放ET-1進而導致PAH。在此基礎上，Park等[32]發現HPAEC中BMP9可通過Smad1和p38 MAPK介導顯著刺激ET-1釋放，從而誘導內皮細胞小管形成，導致肺血管重塑。上述研究在一定程度上支持BMP9在PAH發病中的促進作用。此外，研究[47-48]發現血漿ET-1水平與PAH患者血流動力學嚴重程度呈正相關，與預后呈負相關。近年來隨著對BMP9信號通路的深入了解，越來越多的非遺傳臨床證據支持BMP9信號減少在PAH發病中的因果作用[49]。Long等[38]實驗發現BMP9不僅保護肺動脈內皮細胞免于凋亡并促進血管穩定性，還增加了BMPR2基因表達及信號傳導，其中BMPR2在維持內皮完整性及屏障功能方面有著重要的作用。在體外，BMPR2丟失使HPAEC傾向于凋亡，內皮增殖并增加HPAEC單層通透性；在體內，BMPR2喪失導致肺血管通透性增加。應用重組BMP9直接增強內皮BMP信號傳導可以預防和逆轉幾種遺傳和非遺傳臨床前嚙齒動物模型中的PAH，為使用重組配體靶向治療PAH提供了可能性。Dunmore等[50]首次報道了BMPR-Ⅱ依賴溶酶體的降解機制，并通過實驗證實溶酶體抑制劑氯喹可通過抑制BMPR-Ⅱ降解進而增加其水平，同時改善了下游信號傳導。相比之下，Tu等[51]研究發現，BMP9通過誘導ET-1等因子和抑制腎上腺髓質素和apelin等血管舒張因子而賦予血管收縮作用，從而提出選擇性抑制BMP9可部分抑制實驗性PAH。最近又通過對小鼠進行BMP9單基因敲除、BMP9+BMP10雙基因敲除，發現BMP9基因敲除減弱了慢性缺氧誘導的肺小動脈肌化，且BMP9缺陷小鼠ET-1明顯下降[52]，從而進一步驗證了其之前的結論。

通過上述研究，可以明確BMP9參與了PAH發病。那么，既然POPH作為1類PAH的一部分，那BMP9是否參與了POPH發病？如果參與了發病，其在POPH發病中發揮了正面還是負面作用？為了尋找答案，Nikolic等[22]對暴露于低氧的小鼠應用BMP9配體陷阱ALK1-Fc，結果發現其加劇了小鼠PAH和肺血管重塑，直接證明了BMP9的保護作用，從而提出獲得性BMP9信號轉導缺陷可導致PAH。之后其又對POPH及1類PAH的其他病因、2類PAH和3類PAH的BMP9水平進行了測量，發現POPH患者循環BMP9明顯減少，同時監測BMP9拮抗劑可溶性內切酶(sEng)，結果顯示POPH患者sEng水平更高。通過上述實驗分析，Nikolic提出BMP9是POPH敏感和特異性生物標志物，通過臨床數據分析，其又指出BMP9可預測無移植生存率和肝臟疾病中PAH存在。隨著當前醫療技術的不斷發展，POPH診斷逐漸進入臨床，心電圖、胸片、血氣分析、肺功能、超聲心動圖等對POPH診斷率偏低，而右心導管插入術作為POPH診斷標準，因其為有創操作，且肝硬化患者凝血功能差，故右心導管插入術一般不被接受。因此，尋找無創性非侵入性POPH生物標志物是非常有益的。

5 小結與展望

BMP9作為內皮細胞保護因子和血清靜止因子，其抑制內皮細胞凋亡、遷移、增殖和維持血管穩態。在上述報道和探索中，BMP9信號通路通過其自身及受體和下游效應物參與PAH及POPH發病機制中的作用已得到證實，然而BMP9參與POPH的具體發病機制比較復雜，仍需要進一步研究。由于POPH患病率低，POPH樣本量少導致關于BMP9信號通路參與POPH發病機制的研究受限，因此仍需要收集大量樣本進行研究。因POPH通常無特異性表現，臨床醫生在評估門靜脈高壓患者時，特別對于血氧飽和度<95%或存在呼吸困難、疲乏、胸痛、暈厥、咳嗽明顯患者，應及時完善超聲心動圖等相關檢查，從而早期發現POPH，隨著包括BMP9信號通路在內的POPH發病機制相關研究的深入，有望為POPH的治療開辟新路徑。

利益沖突說明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：張瑞華負責課題設計，資料分析，撰寫論文；秦婷婷、邵玥明、張雨參與收集數據，修改論文；溫曉玉負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。