缺氧誘導因子對肝細胞癌的作用機制及臨床意義

李宏一，羅業浩，羅筱凡，吳 笛，秦黃冠，藍紹航，呂 挺，龐宇舟

1 廣西中醫藥大學，廣西壯醫應用基礎研究重點實驗室，南寧 530200； 2 湖北民族大學 醫學部，湖北 恩施 445000

根世界衛生組織[1]估計，2030年將有100多萬患者死于原發性肝癌。原發性肝癌包括肝細胞癌(HCC)、肝內膽管癌和混合型肝細胞癌-膽管癌，其中HCC占比約85%[2]。HCC的發生是一個逐步的過程。慢性肝炎病毒感染、過量飲酒和非酒精性脂肪性肝炎可導致肝臟炎癥和組織損傷，是HCC的主要病因。肝損傷可擾亂肝血管系統、正常血流和O2供應，形成一個缺氧的微環境。缺氧的Kupffer細胞、巨噬細胞和肝細胞可激活肝臟中的肝星狀細胞，加快膠原蛋白沉積，導致纖維化和肝硬化，從而進一步加劇缺氧。缺氧也可影響不同免疫細胞(如NK細胞)的活動，并抑制HCC微環境中許多不同類型免疫細胞的浸潤和積累，包括腫瘤相關巨噬細胞(TAM)、髓源性抑制細胞(MDSC)和中性粒細胞。O2水平隨著HCC的發展而降低，從而促進免疫抑制微環境的形成[3]。缺氧誘導因子(HIF)是參與細胞對缺氧適應的核心參與者，并受氧感應脯氨酰羥化酶的調節。缺氧通過氧化還原效應和HIF的穩定作用影響細胞生長的諸多方面。HIF亞型可能通過改變代謝、生長和自我更新對腫瘤生長產生不同的影響，并可能高度依賴于環境。HIF通過促進血管生成影響癌細胞的遷移、侵襲和轉移、增殖，促進糖酵解，治療抵抗，免疫逃避等方式影響HCC的發病和進展[4]。探究HIF對HCC的作用機制及臨床意義，有望拓展診治HCC的新方法。

1 HIF的特性

HIF是異二聚體，由α-亞基(HIF-α，包括HIF-1α，HIF-2α/EPAS1和HIF-3α)和β-亞基(HIF-β，包括HIF-1β/ARNT1、ARNT2和ARNT3)組成。在人類和其他脊椎動物中，存在3種不同的HIF基因。在有氧(常氧)的情況下，HIF-α相互作用并與vonHippel-Lindau(VHL)蛋白結合，從而激活泛素連接酶系統，導致HIFa的蛋白酶體降解，HIF-1α蛋白的表達被抑制到非常低的水平。而在缺氧期間，脯氨酰羥化酶不活躍，導致HIF-α穩定并與HIF-1β二聚。二聚化后，HIF易位至細胞核，與包含序列5[0]-[A/G]CGTG-3[0]的啟動子區域內的E-box樣缺氧反應元件結合。HIF激活控制細胞氧穩態的基因，包括紅細胞生成/血管生成和線粒體代謝有關的基因。缺氧細胞通過主要由HIF調控的轉錄和轉錄后機制對抗壓力。這些分子變化使細胞能夠適應缺氧，主要通過轉用糖酵解來降低耗氧量，并減少細胞分裂(如細胞分裂)所需的能量。大多數實體瘤都有一定程度的缺氧，這與臨床療效有關。HIF活性的誘導上調了涉及癌癥許多特征的基因，包括代謝重編程，細胞增殖、侵襲和轉移以及對治療的抵抗[5-6]。

除了氧依賴性機制外，HIF的表達和活性還受氧非依賴性機制的控制，這些機制調節了基因轉錄、mRNA翻譯、蛋白質-蛋白質相互作用和HIF-1α亞基的翻譯后修飾。在炎癥反應中，HIF-1α基因的轉錄上調是以NF-κB依賴性方式實現的，并涉及信號轉導和轉錄激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)和Sp1。此外，生長因子對PI3K/AKT通路的激活可導致HIF-1α mRNA和蛋白質合成增加。HIF-1α也通過與其他蛋白質的結合而受到調節[7]。

2 HIF在HCC中的作用機制

2.1 HIF通過促進糖酵解使HCC適應低氧應激 常氧環境中的細胞將葡萄糖轉化為丙酮酸，丙酮酸進入三羧酸循環并在線粒體中氧化磷酸化，最終產生三磷酸腺苷。腫瘤細胞則表現出葡萄糖消耗增加和向糖酵解的重要代謝轉變，丙酮酸轉化為乳酸。即使在有氧條件下，腫瘤細胞中的這種代謝轉變依然存在，被稱為Warburg效應[8]。通過AKT和HIF-1α介導的MAP17表達上調，將促進Warburg效應[9]。腫瘤細胞通過在無氧糖酵解中來產生能量，相關研究發現這一過程主要由HIF-1α調節。許多參與糖酵解的關鍵酶是HCC細胞中直接的HIF-1α靶標，包括PGK1、PGAM1、HK2、ENO1、ALDOA、GPI、GAPDH、LDHA、PFKFB4和PKM2等[10]，同時HIF-1α可誘導多種糖酵解蛋白同種型(包括GLUT1和GLUT3)的過度表達和活性增加，這對于糖酵解通量控制十分重要[11]。此外，HIF-1α增加了線粒體相關酶的表達，如丙酮酸脫氫酶激酶1，其可抑制丙酮酸轉化為乙酰輔酶A，從而減少線粒體的氧化磷酸化水平和耗氧量[12]。而HIF-2α影響脂質代謝來進行能量代謝，如缺氧下，PI3K/AKT/mTOR通路可能是HIF-2α調控HCC的脂質代謝途徑，進而促進HCC適應無氧環境的重要機制[13]。總的來說，研究顯示HIF從不同途徑促進了HCC的糖酵解，以適應低氧應激。

2.2 HIF通過促進血管生成促進HCC生長 HIF-1α是血管內皮生長因子(VEGF)表達的主要調節因子。在缺氧條件下，高水平積累的HIF-1α上調VEGF等一系列血管生成因子的表達，增強相關mRNA的轉錄，最后促進腫瘤血管生成[14]。HIF-2α也是調節肝細胞中VEGF和其他血管生成因子的主要HIF[15]。HIF-2α主要作用于血管生成相關基因，包括VEGF、促紅細胞生成素、VEGF受體2(VEGFR2)、血管生成素和酪氨酸蛋白激酶受體TIE-2[16]。

除VEGF外，許多其他信號分子在缺氧條件下也通過HIF依賴性機制高表達，包括胎盤生長因子、血小板衍生生長因子β和基質衍生因子1[17-19]，均可促進腫瘤中的血管生成。ANG樣蛋白4也被鑒定為HIF-1α的基因靶標，其可通過調節血管細胞黏附分子和整合素β1的表達來影響HCC血管生成和轉移[20]。因此，HIF促瘤血管的生成可促進HCC的生長。

2.3 HIF通過介導侵襲轉移促進HCC進展 HIF誘導的腫瘤擴散的機制包括上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、TWIST等基因的激活和GLUT1等參與癌癥代謝的轉錄因子的激活。EMT涉及多種類型的腫瘤和多種腫瘤轉移機制[21]。在HCC細胞中，缺氧條件下可通過SNAI1、SIP1、TGFβ、ROS、Notch、NF-κB、Wnt/β-catenin、PI3K/AKT等途徑的活化來誘導EMT，上皮細胞轉變為可移動的基質細胞，獲得遷移到遠處部位的能力[22]。細胞外基質(ECM)重塑在腫瘤侵襲和轉移中發揮著至關重要的作用。參與ECM的幾種酶沉積和重塑受缺氧和HIF的調節，包括基質金屬蛋白酶、2-酮戊二酸5-雙加氧酶、賴氨酰氧化酶、膠原蛋白脯氨酰4-羥化酶等，同時通過HIF-1α依賴性機制，可下調HCC細胞中金屬蛋白酶2組織抑制劑的表達[23]。HIF-1α/LOX通路通過依賴于肝炎反式激活蛋白X的機制，參與ECM重塑和促進HCC轉移[24]。

此外，微小RNA(microRNA，miRNA)也與腫瘤的遷移和轉移密切相關。例如，miR-23是一種常見的致癌基因，研究[25]顯示，miR-23a/b可以通過VHL-HIF-1α通路促進HCC的發病進展。通過抑制SMC4可顯著抑制HCC細胞的遷移，而HIF-1可通過轉錄調節和抑制miR-219來增加SMC4的表達。因此，HIF-1/miR-219/SMC4調控通路可能是促進HCC的遷移和轉移一種機制[26]。此外，HIF-1α/miR-671-5p/TUFT1/AKT也可能是一種機制[27]。lncRNA也可促進HCC轉移，lncRNA鋅指蛋白多型2反義RNA1通過調控miR-576-3p/HIF-1α軸促進HCC的增殖和遷移[28]。此外，lncRNA可抑制HCC的轉移，如lincRNA-p21可下調HIF-1α來降低VEGF水平，從而抑制HCC的侵襲能力[29]。因此，需要更多研究從非編碼RNA層面來闡明HIF的作用機制，挖掘非編碼RNA靶向藥物。

2.4 HIF通過介導免疫逃避、癌癥干細胞促進HCC發生發展

缺氧與HIF和腫瘤細胞逃避免疫反應有關。免疫細胞的功能受HIF1依賴性信號機制的調節，在缺氧期間，HIF誘導腫瘤細胞對CD8細胞毒性T淋巴細胞和NK細胞產生抗性，其可能是HIF通過AMPK/CREB信號增加IL-10表達，分泌的IL-10通過STAT3信號通路抑制NK細胞的細胞毒性，從而促進HCC的復發和轉移[30]。此外，缺氧可以上調產生腺苷的細胞外酶CD39和CD73的表達，增加其在細胞環境中的濃度。腺苷通過與其A2A受體結合，強烈抑制活化的T淋巴細胞和NK細胞的抗腫瘤功能[31]。HIF還可以通過作用于TAM來抑制對腫瘤的免疫反應。研究[32]認為，TAM通過分泌細胞因子，如IL-10、TGFβ、IL-6、VEGF和IL-8，促進腫瘤細胞的生長、侵襲和轉移。

MDSC具有免疫抑制活性，可使癌癥逃避免疫監視并對免疫無反應。通過MDSC介導L-精氨酸的消耗，阻礙T淋巴細胞增殖，并與T淋巴細胞受體亞基CD3的下調相關，導致T淋巴細胞受體反應降低。肝腫瘤的MDSC水平升高，MyD88-NF-κB通路的激活刺激IL-10的分泌，從而抑制樹突狀細胞中IL-12的表達。MDSC也通過細胞表面的TGFβ和NK受體p30誘導NK細胞失活。此外，MDSC還通過誘導CD4+CD25+叉頭轉錄因子3+調節性T淋巴細胞的產生來抑制免疫反應從而促進了HCC的發生發展[33]。

癌癥干細胞(CSC)在腫瘤的發生、發展、復發和轉移中也具有重要作用。HIF因子可利用各種機制影響CSC的誘導和發育。這些機制可能是通過誘導CSC標記，CD44、ALDH，腺苷/STAT3/IL-6途徑，MAPK/ERK途徑，NOTCH和Wnt信號傳導或其他機制促進CSC的繁殖[34]。缺氧可顯著增強HCC細胞的干細胞相關特性，這種作用可以通過敲低HIF-1α或HIF-2α來消除。此外，HIF-1α特異性干擾RNA處理，在RNA和蛋白質水平顯著降低CSC中CD133的表達。重要的是，EMT激活可以誘CSC特征。Notch1通過與HIF-1α的直接相互作用介導EMT誘導的CSC的過程；HIF-1α上調Notch的細胞內表達可激活EMT并誘導HCC細胞在體外獲得CSC的特征。

迄今為止，大多數研究報道了HIF-1α和HIF-2α對腫瘤生長的積極作用。然而，另有研究[35]顯示，HIF在一些其他癌癥中表現出相反的影響，如缺氧可降低野生型(HIF-1α+/+)胚胎干細胞的增殖并增加細胞凋亡。因此，尚需更多研究探析HIF對HCC生長遷移的具體作用。

總結HIF在HCC中的作用機制見圖1。

圖1 HIF作用于HCC的作用機制示意圖

3 HIF在HCC中的臨床意義

3.1 HIF在HCC中的治療應用 HIF抑制劑有望成為一種有效的HCC治療方法，抑制HIF-1α活化可能有助于阻止癌癥進展，從而使生長的腫瘤細胞缺乏O2和所需的營養供應。當前已發現不同的化合物或藥物可通過不同的分子機制阻斷HIF的活性，包括減少HIF-1α的蛋白合成，代表藥物如mTOR抑制劑、強心苷、拓撲異構酶抑制劑和合成寡核苷酸等；降低HIF-1α mRNA的水平，如前藥AFP-464的氨基黃酮成分藥物；增加HIF-1α的分解，如HSP90抑制劑、抗氧化劑和硒甲基硒代半胱氨酸藥物；減少HIF亞基的異二聚化，如吖啶黃藥物；減少DNA與HIF的結合，并降低轉錄活性，如蒽環類和棘霉素等[36]。研究[37-38]顯示，一些中藥方劑或中草藥提取物也具有抑制或降低HIF-1α的作用，如益氣化瘀解毒方、水飛薊的提取物——水飛薊素等。

HIF也可能參與了HCC化療藥物耐藥性的發展。索拉非尼是一種具有抗增殖、抗血管生成和促凋亡特性的多激酶抑制劑，但由于產生耐藥細胞，其療效不佳，可能是長期索拉非尼治療后導致補償性生長途徑的激活，或者缺氧誘導的自噬，從而使HIF介導的細胞反應觸發對缺氧微環境的適應性機制。因此，HIF抑制劑可以與現有療法聯合使用，以增強常規療法的敏感性和效果[39]。例如，辛伐他汀可通過抑制HIF-1α/PPAR-γ/PKM2軸，使HCC細胞重新對索拉非尼敏感[40]。此外，有研究[41]顯示，HIF-1α可通過促進HCC干細胞特性，促進其對表阿霉素化療藥物的耐藥。

然而，開展相關臨床研究時必須謹慎。例如，由于HIF抑制劑可能加劇胰島素抵抗損傷，并抑制肝再生。因此，對于因行肝臟手術的HCC患者，應停止HIF抑制劑治療[42]。

3.2 HIF在HCC預后評估中的應用 HIF可通過多種途徑影響HCC的發生發展，也因此被納入HCC預后評估的相關研究中。有研究[43]顯示，HIF-1α相關基因的過度表達與轉移和病死率有關，HIF-1α陽性表達與HCC合并肝硬化患者血管浸潤、TNM分期、HBV感染、腫瘤大小、門靜脈腫瘤血栓顯著相關。如上所述，HIF通過不同方式影響了HCC的發病和進展。因此，HIF相關指標水平的測定有望為HCC預后評估提供價值。

KIAA1199是一種與癌癥轉移相關的蛋白質，其與HIF-1α在許多人類癌癥中上調，機制上與血管浸潤、腫瘤TNM分期、HBV感染、腫瘤大小和肝硬化顯著相關，提示KIAA1199聯合HIF-1α檢測對評估HCC患者的存活時間、預后情況有潛在價值[44]。其他如YTHDF1、DAAM2、H3K9me2、H3K9me3、Rpn10等作為HCC預后標志物也被相關研究[45-48]初步證實了臨床價值，這些標志物聯合HIF-1α檢測或許能夠作為評估HCC預后的新方法。

4 討論與展望

總結現有研究，HIF在HCC中的主要作用是通過促進糖酵解、血管生成、侵襲轉移、免疫逃避、癌癥干細胞等方式，影響HCC的發生發展以及對治療耐藥，也由此引出了通過HIF靶向治療HCC和評估HCC預后的新設想。然而，HIF在HCC中的相關研究仍有諸多值得深入探究的問題：(1)既往研究主要著眼于HIF-1，HIF-2次之，而HIF-3的相關研究甚少。已有證據[49]顯示，HIF3 AmRNA被差異剪接以產生多種HIF-3α變體，這些變體促進或抑制其他HIF復合物的活性，不同的HIF-3變體具有不同甚至相反的功能。(2)已有研究提供了關于HIF-2α在HCC生長和進展中的穩定性、轉錄活性和作用的信息，但在HCC中的確切作用尚存爭議。有研究[50]認為HIF-2α在腫瘤中可能具有某些積極作用。(3)HIF檢測評估預后也存在爭議，且尚不完全清楚HIF-1、HIF-2、HIF-3三者在HCC中存在哪些相互作用。相關研究[51]發現，單獨敲除HIF-1α或HIF-2α未能顯著減小腫瘤體積(HIF-1α敲除后HIF-2α的表達增加，HIF-2α敲除后HIF-1α的表達增加)，而同時敲除HIF-1α和HIF-2α之后效果可見腫瘤體積顯著縮小。因此，HIF-1、HIF-2、HIF-3之間是否存在一些相互調控作用及其具體機制？如果存在相互調控作用，靶向HIF-1α治療和HIF-1α評估預后的同時，是否要考慮HIF-2和HIF-3的影響？這些問題有待更多研究探明，以提升相關藥物研發的成功率及HIF應用于臨床的可靠性。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：李宏一負責課題設計、資料分析及撰寫論文；羅筱凡、吳笛、秦黃冠負責文獻檢索及資料整理；藍紹航、呂挺參與收集數據及修改論文；龐宇舟、羅業浩負責選題、擬定寫作思路，并最后定稿。