基于《中華醫典》探討金銀花用藥規律及核心組合藥物的現代藥理活性挖掘＊

劉 雙 ，耿 煒 ，張紅艷 ，王 凱 ，王 曉 ，董紅敬 ＊＊

（1.齊魯工業大學（山東省科學院）山東省分析測試中心 濟南 250014；2.齊魯工業大學（山東省科學院）藥學院 濟南 250300；3.山東省婦幼保健院 濟南 250014；4.山東中醫藥大學第二附屬醫院 濟南 250014）

金銀花（Lonicera Japonica Thunb.）又名忍冬花，是忍冬科忍冬屬植物忍冬的干燥花蕾或帶初開的花[1]。金銀花具有悠久的藥用歷史，“金銀花”一名出自《本草綱目》，由于忍冬花初開為白色，后轉為黃色，故得名金銀花[2]，金銀花具有清熱解毒、疏風散熱的功效，是一味臨床常用中藥。傳統中藥復方是我國的文化瑰寶，復方是多種中藥以配伍形式組成，中藥的配伍原則是古人的智慧結晶，而藥對是中藥配伍的基本形式，藥對是連接中藥與方劑的樞紐[3]。藥對雖組成簡單，但具有協同增效或配伍減毒等作用，且體現了歷代醫學家臨床用藥的經驗總結[4]。

網絡藥理學是近年來的新興學科，是闡明藥物-成分-靶點-疾病之間的內在聯系、揭示藥物的作用途徑的一門前沿學科[5]。網絡藥理學基于系統生物學和多向藥理學研究理論、高通量篩選和網絡分析及可視化技術等，系統地、整體地分析中藥復方[6-8]，有利于從分子機制層面闡明成分在預防或治療疾病方面發揮作用的途徑，揭示中藥多成分-多靶點-多途徑的效用特點[9]，綜合地反應藥物對疾病網絡的干預機制，這與中藥整體性、系統性治療疾病的特點不謀而合，已成為分析中藥作用機制的有力工具[10-11]。如采用網絡藥理學探究黑逍遙散治療阿爾茨海默病的作用機制[12]，運用網絡藥理學挖掘巴西人參的核心功效[13]。因此，采用數據挖掘技術挖掘金銀花的核心藥對并借助網絡藥理學預測核心藥對的現代藥理活性，可為金銀花藥對的發現及深入研究提供理論基礎。

圖1 研究思路流程圖

本文以《中華醫典》中含金銀花的處方為基礎，借助數據挖掘技術和網絡藥理學技術分析含金銀花組方的用藥規律并分析核心藥物組合的現代藥理活性，通過細胞實驗驗證其現代藥理活性（見圖1），以期為傳統復方的研究與開發以及“老藥新用”提供新思路。

1 材料與方法

1.1 數據來源、數據篩選及處理

通過《中華醫典》數據庫（http://www.tcmbook.cn），以“金銀花”為關鍵詞，檢索含有“金銀花”的中藥復方，檢索時間為建庫至2021年10月25日。

給藥方式為口服的中藥復方被納入分析范圍。根據《中國藥典》2020版以及《中華本草》來規范各處方的中藥名稱。如：生地規范為地黃、熟地規范為熟地黃、生芪規范為黃芪等。

1.2 用藥規律分析

將篩選并規范好的中藥復方錄入Excel表格中，由雙人負責數據審核，以確保數據的準確性。借助數據透視表對中藥的使用頻次進行統計。將數據整理成Y和N的格式，即復方中含有這味藥標記為Y，不含有這味藥物標記為N，最后添加一組全為N的復方。借助SPSS Modeler 18.0軟件進行復雜網絡分析，通過源節點導入Excel格式數據，選擇字段面板中的類型節點，將數據類型設置為標記，角色設置為任意，連接數據節點與數據類型節點。選擇圖形面板中的網絡節點并插入，連接類型節點與網絡節點，分析條件設置為僅顯示true值標志，可顯示的最大鏈接數為55，“強鏈接下限”為30，“弱鏈接上限”為10，按照鏈接大小顯示強/正常/弱類別以顯示關聯應用網絡圖，其中，連線的粗細表示兩種藥物在同一復方中出現的頻率。通過SPSS Statistics 26.0軟件進行聚類分析，并借助Cytoscape軟件[14]實現網絡可視化。

1.3 現代藥理活性挖掘

1.3.1 藥物作用靶點的獲取及其與疾病的相互作用關系

綜合分析頻次統計、復雜網絡、關聯規則分析結果，篩選出核心藥物組合。通過TCMSP數據庫[15]（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）和TCMIP數據庫[16]（http://www.tcmip.cn/）獲取核心藥物的化學成分及作用靶點，并進行去重和規范，采用String數據庫[17]（https://cn.string-db.org/）查詢靶點蛋白對應的基因名稱。

CTD數據庫（http://ctdbase.org/）是一個強大的、公開的研究資源，是用于描述化學物質、基因和人類疾病之間關系的科學依據，CTD數據庫收錄了許多描述跨物種化學基因/蛋白質相互作用和化學-疾病關系以及基因-疾病關系的精確數據[18]。借助CTD數據庫，分析所有靶點相關的潛在疾病；通過Excel中的數據透視表統計靶點的出現頻次，得到出現頻次較高的靶點作為關鍵靶點，利用Excel使關鍵靶點與疾病相互映射，利用Cytoscape軟件構建“中藥-關鍵靶點-疾病”網絡并分析拓撲網絡，分析藥-靶-病之間的內在關系。

1.3.2 生物功能富集分析

采用String數據庫分析關鍵靶點的蛋白互作網絡（PPI），進一步篩選核心靶點，基于DAVID數據庫[19]（https://david.ncifcrf.gov/）對關鍵靶點進行GO富集分析及KEGG通路富集分析。

2 核心藥物組合的體外驗證

結直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，在惡性腫瘤中發病率位居第三，死亡率位居第二。HCT116細胞是1979年從一位患結直腸癌的男性病人中分離得到的，HCT116細胞已成為結直腸癌研究領域中被廣泛使用的模式細胞。綜合分析數據挖掘的結果，選擇HCT116細胞可作為研究對象進行體外驗證。

2.1 細胞、試劑與儀器

人結腸癌細胞（HCT116）；金銀花、甘草均夠自漱玉平民大藥房千佛山東路店，金銀花提取物、甘草提取物、金銀花-甘草提取物為課題組自制（取50 g金銀花，精密稱定，置1000 mL圓底燒瓶中，精密加入400 mL蒸餾水，放入電熱套中進行水浴加熱，提取1 h，濾過，濃縮，凍干，得金銀花提取物；取50 g甘草，精密稱定，置1000 mL圓底燒瓶中，精密加入400 mL蒸餾水，放入電熱套中進行水浴加熱，提取1 h，濾過，濃縮，凍干，得甘草提取物；取30 g金銀花和15 g甘草，精密稱定，置1000 mL圓底燒瓶中，精密加入400 mL蒸餾水，放入電熱套中進行水浴加熱，提取1 h，濾過，濃縮，凍干，得金銀花-甘草提取物）；RPMI-1640培養基（Gibco公司，批號：8121354）；PBS緩沖液（Solarbio公司，批號：20210526）；胰蛋白酶（Solarbio公司，批號：20210105）；胎牛血清（杭州四季青公司，批號：20050504）；HF90氣套式二氧化碳培養箱（上海力康公司）；Spark多功能微孔板檢測儀（瑞士TECAN公司）。

2.2 細胞培養

從-80℃的冰箱中取出凍存的HCT116細胞（購自中國醫學科學院基礎醫學研究所），置于37℃水浴鍋中迅速解凍，將解凍后的細胞轉移至15 mL離心管，加入適量RPMI-1640培養基混勻后進行離心（1500 r·min-1，5 min），棄上清液。向離心管中加入6 mL 10% FBS 1640培養基，吹打均勻后加到新培養瓶中，搖勻后置于5% CO2、37℃培養箱中培養。待細胞長至80%以上后，棄上清液，加2 mL PBS進行清洗，加1 mL胰蛋白酶在培養箱中消化2 min。加入適量10% FBS 1640培養基吹打細胞使其從瓶底脫離，離心（1500 r·min-1，5 min）后棄上清液，加10% FBS 1640培養基6 mL，吹打均勻后放入新培養瓶中繼續培養。

2.3 MTT法檢測抑制率

取對數生長期的HCT116細胞，經胰蛋白酶消化并反復吹打后制成單細胞懸液，將細胞濃度調整為5×104·mL-1，以每孔100 μL接種于96孔板中，置于37℃，5% CO2培養箱中培養24 h。分別加入5% FBS 1640培養基配制的金銀花組（5 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1、400 μg·mL-1）、甘草組（25 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1、400 μg·mL-1）、金銀花-甘草組（25 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1、400 μg·mL-1）并設置空白組（只含培養基）和陰性對照組（藥物濃度為0），每組各接種5孔，繼續放入培養箱中分別培養48 h、72 h。向每個孔中加入 50 μL MTT溶液（1.0 mg·mL-1）；繼續培養4 h，吸出上清液；加入100 μL DMSO，后用酶標儀在490 nm波長下測定各孔OD值。增殖抑制率按照以下公式計算。

3 結果

3.1 復方數據統計及用藥頻次分析

共統計金銀花組方108首，涉及189味中藥。通過分析發現，使用頻率在10以上的藥物有35味（表1），累計頻次825次，占總頻次的71.06%，屬于高頻中藥。其中，使用頻次前10位的分別是金銀花、甘草、當歸、連翹、赤芍、防風、黃芩、天花粉、皂角刺、牛蒡子。

3.2 關聯規則分析

如圖2所示，在復方中共有26味藥與金銀花配伍使用，其中，金銀花、甘草、當歸、連翹的相關性較強，在金銀花組方中經常一起使用。Apriori算法是用于挖掘數據關聯規則的常用算法，該算法可對事務性數據庫進行挖掘，得到相互關聯的屬性，是多個數據挖掘算法的基礎算法[20]。在關聯規則中，支持度表示前項和后項同時在數據庫中出現的比率，置信度表示前項出現的條件下，后項出現的概率。在建模選項板下，選擇關聯中的Apriori算法，將Apriori節點與類型節點相連接，使用預定義角色，選擇最低條件支持度10%，最小規則置信度80%，最大前項數為5，對藥物進行關聯規則分析。根據Apriori 算法，一共產生202條規則，主要的關聯規則見表2、表3、表4。其中金銀花-甘草聯合使用頻率最高，支持度為65.14%。

3.3 現代藥理活性挖掘

通過以上研究，發現金銀花-甘草聯合使用頻率最高，因此進一步以金銀花-甘草組合為例，通過網絡藥理學方法對“金銀花-甘草”藥對的藥理活性進行了深層次挖掘。

表1 高頻藥物使用統計表（頻次 ≥ 10）

3.3.1 藥物作用靶點的獲取及其與疾病的相互作用關系

基于TCMSP、TCMIP數據庫，建立金銀花、甘草的藥物靶點庫；采用CTD數據庫，獲取與藥物靶點相關的疾病，共有681個疾病，選取度值最高的前10個疾病及其相關靶點，借助Excel中的數據透視表插件，以獲得在較多疾病中出現頻次較高的靶點，稱為關鍵靶點，共53個（表5）。

圖2 金銀花組方的復雜網絡

表2 常用2味藥物組合關聯規則

表3 常用3味藥物組合關聯規則

表4 常用4味藥物組合關聯規則

分別將金銀花與甘草的作用靶點與疾病相互映射，整理、規范，借助Cytoscape軟件建立“中藥-關鍵靶點-疾病”網絡（圖3），網絡共包含65個節點，632條網線。

3.3.2 生物功能富集分析

基于String數據庫建立關鍵靶點的PPI網絡，置信度設置為0.4，借助Cytoscape軟件進行網絡可視化（圖4），分析PPI網絡，節點的大小和顏色深淺表示Degree值的高低，其中，AKT1、IL6、ALB為Degree值前3的靶點蛋白（Degree ≥ 49，ClosenessCentrality ≥ 0.94，BetweennessCentrality ≥ 0.027）。

表5 關鍵靶點

圖3 中藥-關鍵靶點-疾病網絡

通過DAVID數據庫進行關鍵靶點的GO富集分析和KEGG通路富集分析（圖5、圖6）。GO富集分析包括生物過程（Biological process）、細胞組分（Cellular component）、和分子功能（Molecular function）3個部分。其中，關鍵靶點富集的生物過程條目包括RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控（Positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter）、凋亡過程的負調控（Negative regulation of apoptotic process）、細胞增殖的正調控（Positive regulation of cell proliferation）等；細胞組分條目包括細胞核（Nucleus）、細胞質（cytoplasm）、胞質溶膠（Cytosol）等；分子功能條目包括蛋白質結合（Protein binding）、轉錄因子結合（Transcription factor binding）、蛋白激酶結合（Protein kinase binding）等。KEGG通路富集分析結果顯示，關鍵靶點主要富集于HIF-1信號通路（HIF-1 signaling pathway）、PI3K-Akt 信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、TNF信號通路（TNF signaling pathway）等。

圖4 PPI網絡

圖5 GO富集分析

圖6 KEGG通路富集分析

圖7 藥物組抑制率

4 核心藥物組合對人結腸癌細胞增殖的影響

與對照組（抑制率為0）比較，金銀花組、甘草組和金銀花-甘草組，處理細胞48 h后，能對人結腸癌細胞的增殖產生抑制作用，且金銀花組較甘草組以及金銀花-甘草組的抑制作用更強，隨著濃度的升高，抑制作用加強（圖7A）；處理細胞72 h后，金銀花組和甘草組的抑制率較48 h處理后的金銀花組和甘草組有所降低。72 h處理后的金銀花-甘草組的抑制率較48 h處理后的金銀花-甘草組的抑制率高（圖7B），說明不同劑量的金銀花-甘草藥對處理HCT116細胞72 h，對HCT116細胞增殖有較好的抑制作用。金銀花-甘草組對HCT116細胞增殖的抑制作用呈劑量依賴性，隨著時間與金銀花-甘草藥對濃度的上升，對細胞增殖的抑制作用逐漸增強，且濃度越高、時間越長，抑制作用越強。

5 討論

分析傳統復方的用藥規律有利于總結和繼承名老中醫經驗。《中華醫典》是全面系統整理中醫古籍而制成的一本中國歷代醫學古籍。在《中華醫典》收錄的含金銀花復方中，金銀花為君藥或臣藥以發揮清熱解毒功效，如銀花解毒湯、清熱解毒湯中金銀花作為君藥，苦參湯、闌尾化瘀湯中金銀花作為臣藥。當前，金銀花藥對的挖掘研究較少，而藥對是復方的最基本形式；用藥頻次分析結果顯示，甘草在金銀花組方中出現的頻次較高，故兩者有望成為新藥對。甘草號稱中草藥之王，善解百藥之毒。近年來，與甘草組成藥對的研究較多，比如芍藥-甘草藥對[21]、麻黃-甘草藥對[22]、大黃-甘草藥對[23]、苦參-甘草藥對[24]、桔梗-甘草藥對[25]等。甘草固有調和諸藥之功效，但其亦有補氣益中、緩急止痛、清熱解毒等功效，甘草的功效有且不限于調和諸藥。金銀花與甘草合用，一方面可以降低金銀花的毒副作用；另一方面，金銀花和甘草二藥的藥力溫和，對熱度較勝者，僅使用金銀花或甘草，不能達到理想的效果，兩者合用，不僅可以增強金銀花清熱解毒的功效，還可發揮甘草的甘緩護胃的功效，緩和金銀花甘寒對脾胃的影響。

關聯規則顯示，金銀花-甘草、金銀花-甘草-當歸、金銀花-甘草-當歸-防風分別是3類組合組中支持度最高的組合。含有金銀花和甘草的組方多為清熱解毒方，如疏風清熱湯、驅風散、消毒散等。臨床應用發現，金銀花和甘草聯用在治療前列腺炎方面具有較好療效，甘草中的甘草甜素和甘草次酸具有抗炎抑菌作用，黃酮類成分對平滑肌有解痙攣作用，利于消炎排尿；金銀花中的有機酸、黃酮類成分等具有抗菌、抗炎作用，兩者聯用，對前列腺炎療效顯著，可迅速緩解患者病痛，利于恢復[26]。金銀花、甘草、當歸聯用，金銀花清熱解毒，疏風散熱，當歸補血活血，潤腸通便，而甘草可以清熱解毒，調和藥性，三者可以清熱解毒，補血活血；在三味藥的基礎上，再添防風以祛風解表，勝濕止痛。

現代藥理活性研究發現，金銀花、甘草的藥物靶點與腫瘤（Neoplasms）、消化系統疾病（Digestive System Diseases）、心 血 管 疾 病（Cardiovascular Diseases）等有關，展現了中藥廣泛的藥理活性，體現了中藥多靶點的作用特點。目前，金銀花或甘草單獨使用的藥效研究較多，比如研究人員從凍干的金銀花中提取分離出多酚類成分，發現多酚類成分對人組織淋巴瘤細胞具有抑制作用[27]；甘草中的查爾酮A可以通過增加細胞內ROS水平，降低MMP引起線粒體功能障礙和內質網應激誘導人乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡[28]。金銀花，性甘、寒，歸肺、胃經，既能散風熱，又能清胃熱而解毒。甘草在治療常見急、慢性消化道疾病如消化性潰瘍、慢性膽囊炎、膽石癥等方面具有顯著療效[29]。金銀花可以有效地清理血液中的脂肪及有害物質，增加血管血流量，有效預防心肌梗塞等心血管疾病；田行瀚等[30]發現甘草中的甘草查爾酮B、甘草查爾酮C、甘草查爾酮D和刺甘草查爾酮聯合使用對心血管疾病的治療效果顯著。

“中藥-關鍵靶點-疾病”網絡顯示，金銀花和甘草組合使用對腫瘤、消化系統疾病、心血管疾病等具有治療作用，兩味藥物的作用靶點有所差異，ABCC2、ALB、IGF1R為金銀花的特有作用靶點，SIRT1為甘草的特有作用靶點，甘草中的甘草酸可以作用于SIRT1，進而抑制HMGB1的表達，對SAH后神經功能損傷具有改善作用，能明顯抑制腦部水腫，神經細胞凋亡[31]。在KEGG通路富集分析結果中，通過調節HIF-1α信號通路，可以改善H/R誘導的心臟微血管內皮細胞功能障礙[32]；通過干預PI3K/AKT信號通路，可減輕心肌凋亡程度，表現出對心肌細胞的保護作用[33]。此外，PI3K/Akt信號通路過度表達和活化與腫瘤的進展密切相關，上游分子通過與PI3K結合，使其構象發生改變，從而磷酸化激活Akt，Akt的活化能調控其下游分子，參與腫瘤調控通路[34]，一旦PI3K/Akt信號通路被抑制，細胞增殖的能力便會下降，細胞凋亡增加[35]。TNF信號通路與受體相互作用蛋白、TNF受體相關因子2、TNF相關死亡結構域蛋白以及Fas相關死亡結構域蛋白等相關，在促進細胞凋亡及炎癥反應中發揮重要的作用[36]。

體外實驗結果表明，相比于單獨使用金銀花或甘草，核心藥物組合金銀花和甘草對結腸癌細胞增殖的抑制作用更強，抑制活性的提高可能是兩種中藥金銀花和甘草中的化學成分生成了新的化學成分，這體現了中藥配伍的必要性及科學性，也證實了中藥復方絕不是簡單的機械相加或組合，而是相輔相成又各司其職；此外，隨著濃度的上升，金銀花-甘草組的抑制活性逐漸增強，呈劑量依賴性；隨著時間的延長，金銀花-甘草組的抑制率逐漸提高，表明該藥對的治療效果顯著且藥效持久。

綜上所述，本研究采用數據挖掘技術對《中華醫典》中含金銀花的組方用藥規律進行了分析和探討，發現金銀花組方中甘草、當歸、連翹、赤芍、防風等與金銀花同時使用的頻次較高，明確了含金銀花組方的相關藥物配伍規律，挖掘出使用頻次較高的金銀花-甘草藥對。運用數據挖掘及網絡藥理學探討了金銀花-甘草藥對的現代藥理活性及潛在作用機制，通過人結腸癌HCT116細胞增殖抑制實驗對預測出的現代藥理作用進行成功驗證，證實金銀花-甘草藥對較單藥使用的效果好且療效持久，體現了中藥配伍的科學性、可行性和必要性，也為中藥藥對的挖掘與應用、傳統藥對新用途的發現提供了新思路。