趨化因子CCL5在COPD患者誘導痰與自發痰中的差異性研究

郭青春 張杰根 高雅倩 呂永盛 周鵬飛 李欽招

大量研究發現COPD患者氣道炎癥反應明顯增加，但其作用仍存在爭議[1-3]。誘導痰采樣，是一種非侵入性的檢測方法，近20年來其操作方法已經逐漸被標準化并廣泛應用于臨床[4-7]。霧化和吸入鹽水會增加肺部的排痰量[6]。據報道，誘導痰采樣方法可為80%以上的哮喘和COPD患者提供足夠高質量的痰樣本[8-11]。誘導痰采樣可能會引起支氣管收縮，自發痰和誘導痰中的炎癥標志物水平和細胞計數已經被報道，且有研究發現，哮喘或COPD患者誘導痰中的細胞活性高于自發痰[12-19]。然而很少有研究探討COPD患者的誘導痰和自發痰樣本是否可以互換用于炎癥標志物的分析[20]。本研究比較COPD患者誘導痰和自發痰標本中趨化因子CCL5的水平，評估急性加重期患者行誘導痰檢查的安全性。

資料與方法

一、研究對象

本研究經河北省涿州市醫院倫理委員會審查批準，選取2019年6月至2020年6月我院呼吸內科收治的COPD患者90例，其中穩定期和急性加重期患者各45例，收集每位患者的誘導談和自發痰標本，對痰標本進行炎癥因子檢測。納入標準：(1)患者年齡>40歲；(2)所有患者均符合2020慢性阻塞性肺疾病全球倡議(GOLD)[21]指南對COPD的診斷標準：使用支氣管擴張劑后，FEV1/FVC<0.70，確認存在持續性氣流受限；(3)患者對本研究知情并簽署知情同意書。排除標準：(1)合并其他炎性疾病如類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡或其他結締組織疾病；(2)合并炎癥性腸道疾病；(3)合并惡性腫瘤或血液系統疾病；(4)合并嚴重心、肺、肝、腎功能不全者；(5)不能耐受誘導痰檢查者。

二、方法

1 痰標本的采集和處理：采用超聲波霧化器進行誘導痰的采集。患者在誘導前30分鐘吸入200～400μg沙丁胺醇后進行肺活量測定評估，吸入3%高滲鹽水7分鐘，收集誘導痰液，重復3次。在誘導痰之前同一時間點采集患者的自發痰標本。

每克痰中加入0.1%二硫蘇糖醇4mL，冷凍保存。使用Eppendorf均質器在4℃和600rpm/min的條件下均質15分鐘。加入磷酸鹽緩沖液(PBS)對樣品進行過濾，4℃、450 g/min離心15分鐘后收集上清液至0.5mL試管中蒸發，樣品置于-80℃冰箱保存備用。經過培訓的專業人員使用臺盼藍染色評估痰液中細胞的生存能力。在采樣后30min內對所有樣本進行質控，質控合格的標準為：痰液中細胞數量>100萬個/mL，上皮細胞<20%，白細胞存活率>30%。

2 趨化因子的檢測：使用Luminex? xMAP?技術對痰標本進行趨化因子分析。樣本在Luminex 100儀器上進行處理，結果由STarStation軟件收集和存儲。

三、統計方法

結 果

本研究共納入90例患者，其中男59例(65.56%)，31例(34.44%)；年齡40～72歲，平均(62.50±4.31)歲，既往吸煙史52例(57.78%)，目前吸煙史38例(42.22%)；GOLD(2020)分級：Ⅱ級27例(30.00%)，Ⅲ級53例(58.89%)，Ⅳ級(11.11%)；COPD穩定期和急性加重期各45例，采集患者自發痰和誘導痰標本各90份，誘導痰和自發痰樣本的平均細胞存活率均為98%。

3種炎癥標志物中，趨化因子CCL5在急性加重期的痰標本中顯著升高，且在自發痰中升高的水平較誘導痰更為顯著，而在穩定期時與誘導痰樣本相比，自發痰中CCL5的升高沒有達到統計學意義。其他炎癥標志物IL-6和IL-8在不同時期誘導痰和自發痰樣本中的表達水平均未見明顯趨勢(見表1)。

表1 COPD急性加重期和穩定期患者誘導痰和自發痰中炎癥標志物的比較

在表2中可觀察到自發痰和誘導痰樣本中測量的炎癥標志物與臨床變量間的潛在聯系。對比戒煙者，目前吸煙者自發痰中趨化因子CCL5的水平均明顯升高，在誘導痰中CCL5的升高水平沒有顯著地差異；而IL-6和IL-8兩種炎癥標志物的水平在目前吸煙者和戒煙者的不同痰標本中均沒有顯著的差異。另一方面，GOLD分級處于Ⅲ級～Ⅳ級的COPD患者自發痰和誘導痰中CCL5的水平明顯高于GOLD分級Ⅱ級的患者，且自發痰和誘導痰標本的變化規律時相同的，其余指標無明顯升高趨勢。

表2 吸煙、GOLD分級與COPD患者誘導痰和自發痰標本中炎癥標志物的關系

為了評估急性加重期誘導痰檢查的安全性，本研究計算了所有患者在誘導期間預計FEV1%的下降百分比，結果顯示穩定期預計FEV1%的下降幅度(18.59±4.80)%明顯高于急性加重期(14.60±4.07)%，差異有統計學意義(t值=4.253，P值<0.001)。無論疾病狀態和嚴重程度如何，誘導操作后均沒有不良事件發生。

討 論

本研究結果表明，三種不同的炎癥標志物在誘導痰和自發痰中測量水平的一致性較低。在COPD急性加重期測定時，自發痰樣本中的趨化因子CCL5的水平，顯著高于誘導痰樣本。此外，僅在自發痰樣本中發現吸煙狀態與CCL5之間的有密切聯系，而GOLD分級在自發痰和誘導痰樣本中均與CCL5的水平相關。

有研究表明，PBS和二硫蘇糖醇可能會影響某些細胞因子的復原，從而影響樣本的測量結果[14, 22]。然而，在本研究中所有的痰標本都使用了完全相同的處理方案，因此這應該不會對自發痰和誘導痰樣本之間的測量水平產生不同的影響。另外，所有的炎性標志物都是同時批量測量的，因此潛在的測量誤差大于分批檢測。我們在標本收集結束后在同一時間點對所有的痰液標本都在同一個平板上進行了檢測分析。因此，自發痰和誘導痰樣本之間的測量誤差應該是一致的。第三，本研究結果發現炎癥標志物中CCL5的水平與吸煙只在自發痰中有關聯，在誘導痰中不相關，而GOLD分級與CCL5的關系在誘導痰和自發痰中均有顯著的差異。最后，在病情惡化期間即急性加重期是否選擇進行誘導操作，除了基于患者血氧飽和度的水平之外，還取決于幾個主觀因素；最重要的是，患者是否愿意接受誘導，以及臨床醫生對不良反應的評估。因此，從本實驗設計中不可能得出以下結論，即誘導痰操作在所有的病情惡化期間都是安全的。

雖然早在2002年已經有文章提出關于自發痰和誘導痰樣本是否可以進行比較的研究[6]，但目前已經發表的研究仍較少。在一項關于自發痰和誘導痰中IL-8水平的差異性研究報告中顯示穩定期COPD患者兩種痰中IL-8水平沒有顯著性差異[23-24]。本研究結果也證實在COPD穩定期，IL-6和IL-8水平在自發痰和誘導痰中均沒有明顯的改變。此外，本研究結果還證實在急性加重期也可得到同樣的結果。而在自發痰和誘導痰樣本中IL-6、IL-8水平與臨床變量間的潛在聯系的研究結果中可以發現，雖然與既往吸煙的患者相比，目前吸煙的COPD患者自發痰中IL-6和IL-8的水平略高于誘導痰，但二者之間無明顯的統計學差異。在GOLD分級與炎癥標志物的水平的相關性研究中也發現，雖然GOLD分級Ⅱ～Ⅳ級患者誘導痰中IL-6和IL-8的水平較自發痰略低，但其差異沒有統計學意義。與以上結果不同的是，與誘導痰樣本相比，急性加重期時趨化因子CCL5的水平在自發痰中顯著升高，但在穩定期時這種升高的趨勢尚不明顯。

先前的研究已經證明，誘導早期采集的痰與誘導后期采集的痰具有不同的濃度和細胞組成[25]。位于中央氣道的痰液更可能在早期被采集，故自發痰所采集的痰液最可能來自于中央氣道；而誘導痰標本所采集的痰液可能來自于更遠端的氣道(如支氣管等)。研究表明，中央和遠端氣道在上皮成分[26]、免疫細胞分布[25, 27-28]和可能的呼吸道微生物群組成[29]方面都有所不同。因此，從理論上講，自發痰和誘導痰標本的炎癥標志物水平很有可能存在較大的差異。然而，當患者不能耐受誘導痰檢測或誘導操作的安全性不能確定時，自發痰可能是誘導痰的有效替代方案，并允許在初級醫療保健環境中進行采樣。有研究報道，自發痰中的細胞活性比誘導痰中的細胞活性差[19]。在本研究中，由于從標本采集到加工處理的時間非常短，一般控制在30分鐘以內，故自發痰樣本的存活率與誘導痰樣本中的存活率均很高，平均細胞存活率約為98%。

本研究結果顯示趨化因子CCL5的測量結果的在自發痰和誘導痰中一致性很低，提示我們測量自發痰中炎癥標志物的水平可能會有重要的臨床價值。此外，雖然自發痰和誘導痰中炎癥標志物的比較對某些標志物無效，但對其他標志物如趨化因子CCL5是有效的。在之后研究中可以考慮擴大臨床樣本量并增加測量指標，以便于篩選出可以幫助臨床診斷和治療的有差異的生物標志物。

目前國內外關于重度COPD患者在急性加重期進行誘導操作的安全性的數據仍然很少，在幾項研究中，誘導痰采集是在急性加重期進行的，但這些研究并沒有對該過程可能產生的潛在不良反應進行報道[5, 30-31]。本研究的結果顯示無論是在COPD穩定期還是在急性加重期間，都沒有記錄到不良事件的發生。這一結果與其他報告[32]是一致的，但本研究通過納入嚴重和非常嚴重的COPD患者來進一步擴大研究對象的范圍。然而，應該強調的是，在進行誘導操作前工作人員需要采取必要的預防措施，例如準備充足的急救藥物，并且所有的誘導操作只能由經過專業訓練的醫務人員進行[33]。目前的研究結果提示，在檢測穩定期和急性加重期COPD患者痰標本中炎癥標志物的水平時，有必要說明采樣的方法，因為不同的采樣方法獲得的分析結果可能是不一致的。自發痰和誘導痰標本中炎癥標志物水平的比較可能因每種炎癥標志物的不同而呈現不同的結果，應該在每項研究中加以解決。在不可能進行誘導痰采樣的情況下，與其他樣本相比，自發痰樣本可能會提供一定的臨床價值。