miR-17-5p在肺結核患者外周血中表達變化及臨床意義

湯志森 王德志

肺結核是臨床常見的慢性傳染性疾病，主要由結核分枝桿菌感染引起，是引起人類死亡率升高的主要傳染病之一[1]。在世界范圍內，每年大約有1000萬例以上的肺結核新發病例及140萬例以上的肺結核死亡病例，在國內每年死亡人數達12萬，嚴重威脅人類健康[2-3]。研究發現，部分病人感染結核分枝桿菌后并非立即發病，直到機體免疫力下降或變態反應增強后，才表現出肺結核癥狀[4]。而數據顯示，國內有近一半的人感染結核分枝桿菌，及時診斷肺結核及其活動性并及時治療具有重要意義[5]。目前肺結核臨床診斷方法有細胞因子檢測、細菌學檢測、抗原檢測等，但因耗時長、對樣品要求高及可能出現假陰性等缺點，難以準確診斷肺結核病情從而延誤治療。因此，尋找與肺結核發病相關的基因，快速準確的判斷肺結核發病及其病情，對肺結核治療具有重要意義。微小RNA(microRNA，miRNA)是一種非編碼小RNA分子，長約20～25個核苷酸，參與多種疾病生理、病理過程[6]。近年來研究發現，miRNA不僅在傳染性疾病的發生發展中發揮重要作用，且在結核病病人外周血中穩定存在，已作為新的生物標志物成為結核病研究熱點[7-8]。目前有研究證實，miR-17-5p在調控巨噬細胞抗結核分枝桿菌感染的炎癥反應中發揮重要作用[9]，但在肺結核患者體內的表達尚鮮有研究。本研究將檢測肺結核患者外周血miR-17-5p水平，并探討其臨床意義。

資料與方法

一、一般資料

選取2017年10月至2019年8月在本院就診的肺結核患者(肺結核組)86例作為研究對象。根據肺結核活動性，將肺結核患者分為非活動性肺結核組(33例)和活動性肺結核組(53例)。選取同期進行體檢的健康者(對照組)90例作為對照，肺結核組和對照組性別、年齡、體質指數(body mass index，BMI)比較，差異無統計學意義(P>0.05)(見表1)。

納入標準：(1)肺結核及其活動性診斷符合中華人民共和國衛生行業標準《肺結核診斷》及《結核病分類》[10-11]。(2)臨床資料完整，且受試者依從性高。(3)受試對象知情同意，并簽署有關證明文書。

表1 患者一般資料比較

排除標準：(1)合并臟器損害者。(2)合并惡性腫瘤者。(3)合并全身免疫相關性疾病者。(4)合并其他肺部疾病者。

二、試劑與儀器

RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒(貨號：EX1882-50T、RE0510-100T)購自金克隆(北京)生物技術有限公司；miScript SYBR Green PCR kit(貨號：218076)購自德國QIAGEN公司；人腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)酶聯免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(貨號：SEKH-0047、SEKH-0013)及miR-17-5p、U6引物購自北京索萊寶科技有限公司。

Rotor-Gene?Q實時熒光定量PCR儀購自美國QIAGEN公司；SPECTRAmaxM2e型酶標儀購自美國Molecular Devices公司。

三、血液采集

肺結核患者入院第2日晨起抽取肘部空腹靜脈血，對照組體檢當日抽取肘靜脈血，4℃ 3000 r/min離心10 min，取上層血清，分裝、在-80℃冰箱中保存待用。

四、實時熒光定量PCR法測定外周血miR-17-5p表達水平

將保存于-80℃冰箱的血清樣本200 μL取出，于冰上融化，使用RNA提取試劑盒并按照其說明書抽取總RNA，測定其濃度、純度、完整性后使用反轉錄試劑盒并按照其說明書將總RNA反轉錄為cDNA，-80℃保存。使用miScript SYBR Green PCR kit并按照其說明書配制實時熒光定量PCR反應體系，在實時熒光定量PCR儀上反應40個循環。以管家基因U6為內參基因，采用2-ΔΔCt法表示miR-17-5p表達水平。miR-17-5p上游引物：5′-GCCGCAAAGTGCTTACAGTG-3′，miR-17-5p下游引物：5′-TGCAGGGTCCGAGGTAT-3′；U6上游引物：5′-CAAATTCGTGAAGCGTTCCATA-3′，U6下游引物：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′。

五、ELISA法檢測外周血炎癥因子水平

將保存于-80℃冰箱的血清樣本200 μL取出，于冰上融化，分別使用人TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒，按照其說明書進行操作，用酶標儀測定吸光度(optical density，OD)值，繪制標準回歸曲線，計算TNF-α、IL-6表達水平。

六、統計學分析

結 果

一、肺結核組與對照組外周血miR-17-5p表達水平

與對照組相比，肺結核組患者外周血miR-17-5p表達水平顯著升高(P<0.05)(見表2)。

表2 肺結核組與對照組外周血miR-17-5p表達水平比較

二、肺結核組與對照組外周血炎癥因子表達水平

與對照組相比，肺結核組患者外周血TNF-α、IL-6表達水平顯著升高(P<0.05)(見表3)。

表3 肺結核組與對照組外周血TNF-α、IL-6表達水平比較

三、肺結核患者外周血miR-17-5p表達水平與炎癥因子的相關性

相關性分析結果顯示，肺結核患者外周血miR-17-5p表達水平與TNF-α、IL-6均呈顯著正相關(r=0.524、0.595，P<0.05)(見圖1)。

四、活動性與非活動性肺結核患者外周血miR-17-5p表達水平

與非活動性肺結核組相比，活動性肺結核組患者外周血miR-17-5p表達水平顯著升高(P<0.05)(見表4)。

表4 活動性與非活動性肺結核患者外周血miR-17-5p表達水平比較

五、外周血miR-17-5p表達水平對肺結核及其活動性的診斷價值分析

ROC曲線分析結果顯示，外周血miR-17-5p表達水平區分肺結核患者與健康者的ROC曲線下面積為0.905(95%CI：0.861～0.949)，約登指數為0.684，當診斷閾值為1.365時敏感度為88.4%，特異性為80.0%，見圖2；外周血miR-17-5p表達水平區分活動性肺結核患者與非活動性肺結核患者的ROC曲線下面積為0.756(95%CI：0.681～0.831)，約登指數為0.397，當診斷閾值為1.555時敏感度為48.8%，特異性為90.9%(見圖3)。

圖1 肺結核患者外周血miR-17-5p表達水平與TNF-α、IL-6的相關性分析圖

圖2 ROC曲線分析外周血miR-17-5p表達水平對肺結核的診斷價值

圖3 ROC曲線分析外周血miR-17-5p表達水平對肺結核活動性的診斷價值

討 論

結核病是全世界面臨的公共衛生問題，是現今人類3大感染性疾病之一，其死亡率位于傳染病榜首。每年均有大量人群感染結核分枝桿菌，發展為慢性炎癥疾病，通常以肺結核病居多。流行病學顯示，全球肺結核病人的數量每年以數百萬的速度增加，防治形勢仍非常嚴峻，發病成為活動性肺結核后可導致死亡率大大增加[12]。因此，及時診斷肺結核及其活動性具有重要臨床價值。

近年來，miRNA已被發現廣泛參與細胞各種生物學行為及各種生理、病理反應的調控，包括微生物感染后機體的免疫應答、炎癥等反應。研究發現，宿主被結核分枝桿菌感染后，巨噬細胞表面的Toll樣受體可識別病原體，引發炎癥反應及多種免疫防御機制，進而清除入侵的結核分枝桿菌[13]。而在結核分枝桿菌感染的過程中，巨噬細胞產生的特異性miRNA，可在肺結核病人血液中被檢測到。因此，在結核患者體內差異表達的miRNA，可能參與巨噬細胞調控的炎癥反應、免疫防御過程，有潛力成為診斷結核病及其病情的生物標識。康雪雪等[14]研究表明，hsa-miR-17-5p在哮喘兒童血清中高表達，其機制可能與炎癥、免疫有關，有望成為診斷哮喘的標志物。張蘋等[15]研究表明，丙型肝炎患者血清hsa-miR-17-5p相對表達量顯著升高，與丙型肝炎病毒感染及致病密切相關，有望成為丙肝患者肝損傷判斷的潛在分子標志物。而張帆等[9]研究發現，結核分枝桿菌感染可下調miR-17-5p表達，而miR-17-5p可通過靶向抑制SIRPα表達，上調細胞因子TNF-α表達，進而調控巨噬細胞抗結核分枝桿菌的炎癥反應。洪丹彤等[16]從自噬角度亦發現，miR-17-5p在巨噬細胞抗結核分枝桿菌感染過程中發揮重要作用。本研究結果顯示，肺結核組患者外周血miR-17-5p表達水平較對照組顯著升高，提示miR-17-5p參與肺結核的發生過程。肺結核組患者外周血TNF-α、IL-6表達水平較對照組顯著升高，同時肺結核組患者外周血miR-17-5p表達水平與外周血TNF-α、IL-6表達水平呈顯著正相關，提示肺結核患者體內miR-17-5p的表達與炎癥反應密切相關，并推測miR-17-5p水平升高可能是機體的內源保護反應，可能促進TNF-α、IL-6表達，調控肺結核患者體內炎癥反應，進而清除感染的結核分枝桿菌。

由于miRNA在血液等臨床樣本中穩定性高，可以快速準確定量，有望成為反映疾病發生發展的生物學指標。侯新月等[2]研究顯示，miR-24-3p區分肺結核患者與健康體檢者的敏感度、特異度分別為86%和90%。本研究使用外周血miR-17-5p表達水平診斷肺結核的敏感度、特異性分別為88.4%、80.0%，提示外周血miR-17-5p表達水平對肺結核具有較高的診斷價值。肺結核的活動性，關系到患者的治療措施，及時診斷肺結核活動性對肺結核患者治療至關重要[17]。本研究結果顯示，活動性肺結核組患者外周血miR-17-5p表達水平較非活動性肺結核組顯著升高，提示外周血miR-17-5p表達水平與肺結核患者活動性密切相關。侯新月等[2]研究顯示，miR-24-3p區分活動性肺結核患者與非活動性肺結核患者的敏感度、特異度分別為53.3%和100%。周冰等[5]研究表明，miR-144區分活動性肺結核患者與健康志愿者的敏感度、特異度分別為96.88%和96.77%。本研究使用外周血miR-17-5p表達水平診斷肺結核患者活動性的敏感度、特異性分別為48.8%和90.9%，提示外周血miR-17-5p表達水平診斷肺結核患者活動性的特異性較好，具有一定臨床參考價值。

綜上所述，miR-17-5p在肺結核患者外周血中高表達，在活動性肺結核患者外周血中表達更高，其水平與炎癥因子TNF-α、IL-6水平明顯相關，可用于輔助診斷肺結核及其活動性。