卵巢癌中MSI2蛋白表達及與臨床病理特征的關系

甄 娟，劉玉東，宋春紅，吳 莎，焦瑞芬

卵巢癌是女性生殖系統常見的惡性腫瘤之一，是發達國家婦科癌癥死亡的主要原因[1]。卵巢上皮性癌是最常見的病理類型，占所有類型卵巢癌的90%，由于卵巢位于盆腔內，早期癥狀隱匿，早期診斷缺乏敏感性和特異性均較高的指標，多數患者確診時已為晚期，且卵巢癌極易發生遠處轉移，嚴重威脅著女性的健康和生命。卵巢癌患者標準治療方法是行腫瘤減滅術后接受鉑類化療，盡管一線治療方案已取得較大進展，多數患者仍會復發，并對鉑類化療產生耐藥[2-3]。因此，提高卵巢癌早期檢出率和尋找有效的基因進行靶向治療是提高卵巢癌患者生存率的最重要手段。近來研究發現，MSI2是造血干細胞的重要調節因子，在白血病和多種實體腫瘤中異常表達，且與腫瘤低分化狀態、淋巴結轉移及患者不良預后密切相關[4-8]。由此可見MSI2作為腫瘤促進因子發揮生物學作用，并對臨床評估患者的預后具有重要意義。然而MSI2在卵巢癌中的相關研究較少，本實驗采用免疫組化和Western blot法檢測MSI2在卵巢癌組織中的表達情況，分析MSI2表達與卵巢癌臨床病理特征及患者預后的相關性，尋找卵巢癌新的診斷、靶向治療和預后評估分子標志物。

1 材料與方法

1.1 材料收集2010年1月～2021年10月石家莊市第四醫院/河北醫科大學附屬婦產醫院存檔的婦科手術切除標本164例，其中卵巢癌75例，癌旁正常卵巢組織50例，輸卵管組織39例，所有患者術前均未接受藥物治療及放、化療。標本石蠟包埋切片后經HE染色后明確診斷，診斷標準參照WHO(2020)卵巢腫瘤分類標準和FIGO分期系統。根據病理特征和分子遺傳學改變確定腫瘤類型(其中Ⅰ型卵巢癌36例和Ⅱ型卵巢癌39例)。術中同時留取同一患者的卵巢癌組織及癌旁正常卵巢組織和輸卵管組織，新鮮組織離體后取少量放入EP管立即凍存于液氮后，移入-80 ℃低溫冰箱保存，以備Western blot檢測。本實驗通過了本院倫理委員會審核，且獲得患者知情同意。

1.2 主要試劑兔抗人MSI2單克隆抗體(ab76148)購自Abcam公司，免疫組化SP試劑盒和DAB顯色劑均購自福州邁新公司。

1.3 方法

1.3.1免疫組化 標本均經10%中性福爾馬林固定、脫水、透明、浸蠟、包埋，4 μm厚連續切片。操作過程嚴格按照免疫組化SP試劑盒說明書步驟進行MSI2(1 ∶400)染色。觀察MSI2在卵巢癌組織、癌旁正常卵巢組織及輸卵管組織中的表達部位。判讀標準：陽性標準主要表現為細胞核/質/膜出現清晰的著色及達到一定數量陽性細胞。每張切片隨機選取5個高倍視野(400×)，每個視野計數200個細胞。(1)按細胞著色深淺評分：無細胞著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。(2)按陽性細胞所占百分比評分：無陽性細胞為0分，陽性細胞數≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～80%為3分，>80%為4分。將上述兩項評分相乘作為最終結果：≥3分為陽性，<3分為陰性。

1.3.2Western blot法 將新鮮組織剪碎、裂解、再粉碎、勻漿、離心，提取上清液為總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，取80 μg蛋白樣本進行聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠電泳、轉膜，脫脂奶粉封閉2 h，MSI2與內參β-actin一抗4 ℃孵育過夜，第2天洗膜后與相應二抗37 ℃孵育2 h，發光，掃描圖像并分析各條帶的光密度值，以目的蛋白與β-actin光密度值比值作為相對表達量。

1.3.3隨訪 對所有卵巢癌患者術后進行定期隨訪，主要采用患者門診復查及電話隨訪等方式，平均每6個月隨訪1次，若隨訪期間出現患者死亡，規定其死亡時間為終止時間，亦納入生存分析。

2 結果

2.1 卵巢癌組織、癌旁正常卵巢組織及輸卵管組織中MSI2蛋白的表達免疫組化結果顯示，卵巢及輸卵管組織中MSI2的表達主要位于細胞質，部分位于細胞核(圖1)，其在卵巢癌中的陽性率(73.33%，55/75)高于癌旁正常卵巢組織(16.00%，8/50)及輸卵管組織(12.82%，5/39)，差異有統計學意義(χ2=39.448，P<0.001；χ2=37.686，P<0.001)。MSI2表達與Ⅱ型卵巢癌、高FIGO分期和淋巴結轉移呈正相關(P均<0.05，表1)。

表1 卵巢癌組織中MSI2表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

圖1 MSI2在不同組織中的表達，SP法；A.漿液性癌中MSI2呈彌漫強陽性；B.子宮內膜樣癌中MSI2呈彌漫強陽性；C.黏液性癌中MSI2呈彌漫強陽性；D.透明細胞癌中MSI2呈彌漫強陽性；E.癌旁正常卵巢組織中MSI2呈陰性；F.輸卵管組織中MSI2呈陰性

2.2 新鮮卵巢組織及輸卵管組織中MSI2的表達量Western blot法檢測結果顯示，30例卵巢癌、30例癌旁正常卵巢組織和30例輸卵管組織中MSI2的相對表達量分別為1.14±0.19、0.38±0.06、0.33±0.08。卵巢癌中MSI2的相對表達量高于癌旁正常卵巢組織及輸卵管組織，差異有統計學意義(t=20.702，P<0.001；t=21.271，P<0.001)(圖2)。

圖2 MSI2在卵巢癌組織、癌旁正常卵巢組織及輸卵管組織中的表達：MSI2在卵巢癌組織(C1、C2)中的表達高于輸卵管組織(N1、N2)及癌旁正常卵巢組織(N3、N4)

2.3 MSI2表達與卵巢癌患者預后的關系生存分析結果顯示，MSI2陽性患者中位生存時間為(45.00±4.364)個月；MSI2陰性患者中位生存時間為(60.00±2.137)個月。MSI2陽性患者生存時間及總生存率低于陰性患者(Log-rank檢驗Waldχ2=8.620，P=0.003，表2)。單因素和多因素分析結果表明，MSI2蛋白表達、腫瘤分型、FIGO分期、淋巴結轉移與患者預后相關(P均<0.05，表2，圖3)，MSI2蛋白表達水平是卵巢癌患者不良預后的可選預測因素之一(P=0.031，表3)。

表2 卵巢癌患者總生存率的單因素分析

表3 卵巢癌患者總生存率的多因素分析

圖3 卵巢癌主要臨床病理因素與患者預后的關系：A.MSI2表達；B.FIGO分期；C.淋巴結轉移；D.腫瘤分型

3 討論

MSI(musashi)蛋白家族是高度保守的RNA結合蛋白，在哺乳動物體內，MSI家族有MSI1和MSI2兩個成員，MSI1和MSI2蛋白在N端有兩個高度保守的RNA結合域(RNA banding domains, RBDS)，其序列同源性接近90%，在較不保守的C末端區，顯示了約70%的序列同源性。MSI2基因定位于人染色體17q22，包含328個氨基酸，其編碼蛋白MSI2具有2個剪接體形式(MSI2L和MSI2S)，相對分子質量分別為36.9×103和35.7×103，MSI2通過RNA識別結構序列(RNA recognition motif, RRM)直接識別并與RNA結合，進而抑制翻譯過程，調控細胞生長、分化、增殖及造血干細胞、神經系統的發育。最初研究發現，MSI2過表達會促進白血病的發生、發展，隨后越來越多的研究結果證實MSI2在大部分實體腫瘤中過表達并在腫瘤的增殖、侵襲過程中發揮關鍵作用[9-14]。

研究者利用BioExpress數據庫和MethHC數據庫，分析人類癌癥TCGA的基因表達模式發現，與相應癌旁正常組織相比，許多人類癌癥包括子宮頸癌、前列腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、食管癌、胃癌、結腸癌、乳腺癌和甲狀腺癌等組織中MSI2 mRNA表達增高。隨后在子宮頸癌中做了一系列表型實驗，發現MSI2過表達促進子宮頸癌細胞集落形成，促進腫瘤細胞生長增殖和侵襲遷移，敲低MSI2的表達后，出現相反的結果[15]。Liu等[16]研究結果亦發現，與正常子宮頸組織相比，MSI2在子宮頸癌中的表達明顯增高，且與FIGO分期和淋巴結轉移密切相關，MSI2陽性患者總生存率和無進展生存率明顯下降，Cox回歸分析結果表明，MSI2是子宮頸癌總生存期和無瘤生存期的獨立預測因素。Fang等[17]的研究結果表明，MSI2在肝癌細胞中高表達，過表達MSI2后，腫瘤細胞集落形成和存活率明顯增加，腫瘤細胞凋亡下降，Ki-67表達增高，此外，敲低MSI2表達后，細胞對索拉非尼敏感性增加，表現為腫瘤細胞存活率和集落形成數量減少，凋亡升高，Ki-67表達下降。說明MSI2過表達或敲低改變了腫瘤相關基因的表達、自我更新以及肝癌細胞系對化療的抵抗性，在小鼠異種移植模型中，過表達MSI2能顯著增加腫瘤的體積和質量。同時MSI2過表達導致lin28a水平上調，MSI2和lin28a水平與肝癌患者的臨床嚴重程度和預后呈正相關。Zhao等[18]研究發現MSI2在前列腺癌組織和細胞中高表達，并且與腫瘤分級呈相關性。MSI2在雄激素敏感和不敏感前列腺癌細胞中的下調均能抑制體內腫瘤的形成和體外細胞生長，敲低MSI2后腫瘤細胞集落形成減少，增殖能力下降，移植鼠腫瘤生成速率和生長速度均減慢，推測MSI2在腫瘤形成和生長過程中發揮重要作用，過表達的AR能夠扭轉MSI2敲除后的腫瘤抑制作用，MSI2與AR呈密切正相關。膠質母細胞瘤組織中MSI2高表達，MSI2基因沉默或過表達對腫瘤細胞的侵襲、遷移和增殖有明顯影響。在異種移植模型中，MSI2表達沉默可明顯抑制O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase, MGMT)的表達和腫瘤生長，并逆轉替莫唑胺的耐藥性[19]。在結腸癌、膽管癌和食管癌中的相關研究中發現，MSI2高表達與腫瘤TNM分期和淋巴結轉移等惡性生物學行為有關。MSI2高表達患者的總生存率和無瘤生存期縮短，并且其是總生存率和無瘤生存期的獨立預測因素[20-22]。由此可見，MSI2作為腫瘤促進因子在多種惡性腫瘤的發生及惡性生物學行為中發揮重要作用，且與患者不良預后相關。在卵巢癌中MSI2是否也發揮同樣的促癌作用呢？本組Western blot實驗檢測結果示，MSI2在卵巢癌組織中的蛋白表達量高于癌旁正常卵巢組織及輸卵管組織。與之一致的是，免疫組化結果亦顯示，在卵巢癌組織中MSI2的陽性率高于癌旁正常卵巢組織及輸卵管組織，統計分析結果顯示，MSI2表達與Ⅱ型卵巢癌、高FIGO分期及淋巴結轉移呈正相關，由此推測MSI2可能作為癌基因在卵巢癌的發生、發展及轉移等過程中發揮重要的促進作用。本實驗進一步結合患者的臨床資料進行生存分析發現，高表達的MSI2、Ⅱ型卵巢癌、高FIGO分期及淋巴結轉移的患者總生存率下降，生存期縮短，Cox多因素回歸分析發現，MSI2的蛋白表達水平是卵巢癌患者不良預后的可選預測因素之一。

綜上，本實驗結果表明，MSI2作為促瘤因子在卵巢癌發生、發展、轉移及預后評估過程中發揮重要作用。推測MSI2具有成為卵巢癌診斷標志物和治療靶點的潛在可能，同時為臨床評估患者的預后提供理論依據，然而本實驗只是初步驗證，其在卵巢癌中的具體機制有待積累大樣本進行深入探究。