鼻腔鼻竇EBV陽性漿細胞瘤7例臨床病理分析

李 濤，宋國新，李 霄，孫浩然，李 海，劉 沖

漿細胞腫瘤(plasma cell neoplasms, PCN)是由終末分化的B細胞產生，通常分泌具有重鏈重排的單克隆丙種免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)，或稱M蛋白。PCN包括多種亞型：漿細胞骨髓瘤、漿細胞瘤、Ig沉積病、骨硬化性骨髓瘤(亦稱POEMS綜合征)等，其中漿細胞瘤又分為骨孤立性漿細胞瘤和骨外(髓外)漿細胞瘤。骨外(髓外)漿細胞瘤是發生于骨外軟組織的局限性孤立性腫瘤，最常見于上呼吸道，尤其是老年人的口咽、鼻腔鼻竇和喉等部位，形態學特點類似骨內孤立性漿細胞瘤[1]。近年，有學者發現部分發生于鼻腔鼻竇的漿細胞瘤伴有EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)感染，但WHO(2017)淋巴造血系統腫瘤分類中未提及該特征，目前也僅有少量的個案報道[2-7]，兩者之間潛在的關聯尚不明確。本文著重探討原發于鼻腔鼻竇的EBV陽性漿細胞瘤的臨床病理學特征及其與相關腫瘤的鑒別診斷，為臨床和病理醫師提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料收集2017年1月～2020年12月江蘇省人民醫院/南京醫科大學第一附屬醫院病理學部診斷的22例鼻腔鼻竇漿細胞瘤，其中7例為EBV陽性漿細胞瘤(占31.8%)。

1.2 方法

1.2.1HE及免疫組化 標本均經10%中性福爾馬林充分固定，常規脫水、石蠟包埋、3 μm厚連續切片、HE染色、中性樹膠封固。免疫組化染色采用EnVision兩步法，所用一抗包括CD3(SP7)、CD5(SP19)、CD20(L26)、PAX-5(MX017)、CD79a(MX076)、CD38(MX044)、CD138(MI15)、MUM1(MUM1P)、CD30(Ber-H2)、CD56(MX039)、C-myc(EP121)、Ki-67(MIB-1)等，均購自福州邁新公司，利用Lumatas全自動免疫組化染色儀進行制片。

1.2.2EBER原位雜交 石蠟4 μm厚切片，烘烤后進行脫蠟和水化，隨后進行蛋白酶K處理、雜交孵育、顯色、水洗、蘇木精復染、梯度乙醇脫水、中性樹膠封固等程序。其中EBV編碼的小RNA(EBER)探針購自北京中杉金橋公司，以EBV陽性的鼻咽癌作為陽性對照，用PBS代替探針作為陰性對照，實驗過程中酶處理和雜交孵育過程嚴格遵守無菌操作，保證實驗室和所有器械等均為專用，避免RNA酶污染。陽性結果判斷標準：僅為細胞核著色，胞質和胞膜著色為陰性(核分裂除外)。

1.2.3FISH 石蠟3 μm厚切片2張，烘烤后進行脫蠟和水化，胃蛋白酶消化10 min，后經70%、85%和100%梯度乙醇脫水固定，自然干燥。然后轉入暗室進行基因變性和雜交，加入探針放入原位雜交儀進行雜交反應及后續處理，待實驗完畢，晾干，利用熒光顯微鏡觀察基因的突變形式。C-myc基因斷裂重組檢測試劑盒購自北京金菩嘉公司，所用探針為GLP C-myc(8q24)。判讀標準：10%以上腫瘤細胞出現1個黃色融合信號、1個紅色信號和1個綠色信號為陽性(正常為2個黃色信號)。

1.2.4Ig基因重排檢測 DNA提取試劑盒采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit，引物系統符合BIOMED-2標準，PCR反應液購自上海源奇生物公司，在ABI3130遺傳分析儀上進行片段掃描的克隆性分析，再根據“BIOMED-2解讀指南”進行判斷分析，其中單克隆結果為：目的范圍內出現明確單峰熒光信號或在弱的多信號背景中出現明確單峰信號判斷為單克隆性重排；顯示連續多熒光信號的鐘型曲線判斷為多克隆性重排。實驗過程包含質控要求：若標本在100、200、300、395 bp位置收集到ROX熒光信號(紅色峰)，則表示標本DNA的質量和數量符合要求；反之，重新檢測樣品，若仍無熒光信號則檢測結果報告為“用于檢測的DNA數量或者質量不合格，無法進行檢測”。檢測基因(含有效監測范圍)如下：管家基因(100、200、300、394 bp)、FR1-JH(310～360 bp)、FR2-JH(250～295 bp)、DH-JH(110～290 bp、390～420 bp)、Vk-Jk(120～160 bp、190～210 bp、260～300 bp)、Vk-Kde+intron-Kde(210～250 bp、270～300 bp、350～390 bp)。

2 結果

2.1 臨床特征7例均為老年男性患者，年齡范圍58～70歲，平均65.7歲。發病部位包括鼻腔(3例)、鼻竇(2例)、鼻中隔(1例)、鼻前庭(1例)。腫瘤直徑1～3.5 cm，平均2.2 cm。所有患者均為孤立性偶發病例，無免疫抑制劑治療、器官移植以及漿細胞骨髓瘤等相關病史，主要臨床表現依據發病頻率依次為：鼻出血(5/7)、鼻塞(5/7)、鼻息肉(2/7)、不規則新生物(2/7)、癤腫(1/7)。

2.2 病理特征7例腫瘤性漿細胞呈彌漫實性生長，根據漿細胞分化成熟度分為三個級別：1級2例，腫瘤細胞分化好，具有成熟漿細胞形態，細胞呈卵圓形，核偏位，染色質深染、均質狀或呈“車輻狀”分布在核膜邊緣，無核仁，有豐富的嗜堿性胞質和核周空暈(圖1)；2級1例，腫瘤細胞分化較不成熟，瘤細胞體積大，核染色質疏松，核質比例高，核異型增加，核仁明顯，可見雙核或多核細胞，但胞質仍較豐富、嗜堿性，核周空暈可見(圖2)；3級4例，瘤細胞分化更為不成熟，其中1例呈現漿母細胞樣形態(核大空泡狀，核仁明顯、居中，核分裂易見，胞質較少聚集在細胞膜邊緣，核周空暈不明顯或缺如，圖3)，另外3例呈現間變性形態(顯著的多形性和異形性，圖4)。為進一步觀察腫瘤的病理特征，將本組7例再分為分化成熟組2例和不成熟組5例，其中2例分化成熟組中部分區域仍散在分布較為不成熟的腫瘤性漿細胞。

圖1 腫瘤細胞具有成熟漿細胞形態，異型小，細胞呈卵圓形，核偏位，染色質深染、均質狀或呈“車輻狀”分布 圖2 腫瘤細胞分化較不成熟，瘤細胞體積大，核染色質疏松，核質比例高，核異型增加 圖3 腫瘤細胞呈漿母細胞樣，具有大而空泡狀的細胞核，核仁明顯、居中，核分裂易見 圖4 腫瘤細胞異型性顯著(體積增大，核形不規則、核仁顯著、多核、巨核)，符合間變性特征 圖5 腫瘤細胞彌漫表達CD79a，EnVision兩步法 圖6 腫瘤細胞彌漫表達CD138，EnVision兩步法 圖7 腫瘤細胞彌漫表達MUM1，EnVision兩步法 圖8 具有漿母細胞樣形態特征的腫瘤Ki-67增殖指數高達90%，EnVision兩步法 圖9 EBER原位雜交檢測陽性

2.3 免疫表型腫瘤細胞主要表達CD79a(圖5)以及漿細胞分化的標記，如CD38、CD138(圖6)、MUM1(圖7)，陽性率均為100%，不表達CD20和PAX-5。Ki-67增殖指數為10%～90%，其中分化成熟組為10%～20%，分化不成熟組為40%～90%(圖8)。Ki-67陽性率>70%的3例腫瘤細胞CD30陰性、CD56陽性。

2.4 EBER原位雜交檢測22例漿細胞瘤中7例出現彌漫強陽性，陽性定位于細胞核，呈棕黃色(圖9)，7例切片陽性質控和陰性質控組織較理想著色或不著色，提示EBER原位雜交檢測陽性。

2.5 FISH檢測7例C-myc基因斷裂重組檢測鏡下所見C-myc基因為2個黃色信號或表現為1紅1綠1黃比率<10%，提示C-myc基因均未發生易位。

2.6 Ig基因重排檢測7例均為陽性，其中5例表現為IGH和IHK(重鏈和輕鏈)重排，1例表現為IGH重排，1例表現為IGK重排，涉及的基因及出現頻率為：FR2-JH(6/7)、FR1-JH(1/7)、DH-JH(1/7)、Vk-Kde+intron-Kde(5/7)、Vk-Jk(1/7)。所有病例均可見輕鏈限制性表達(κ或λ)。

2.7 預后7例患者6例獲得隨訪資料，1例失訪，隨訪2.7～40個月，均存活，至今無復發或轉移，其中4例術后進行了放療，1例進行細胞免疫治療，1例未進行治療。

3 討論

漿細胞瘤伴EBV陽性這一特征并未在WHO(2017)淋巴造血系統腫瘤分類中提及，目前僅為少數個案報道[2-9]，文獻報道該現象多見于移植后的漿細胞瘤[4]。本組22例鼻腔鼻竇漿細胞瘤中EBV陽性7例(占31.8%)。腫瘤細胞CD79a、MUM1、CD138、CD38陽性，CD20和PAX-5陰性。Ig基因重排檢測均為陽性并可見輕鏈限制性表達(κ或λ)。C-myc基因斷裂重組檢測均為陰性。患者均為孤立性偶發病例，無免疫抑制劑治療、器官移植以及漿細胞骨髓瘤等相關病史。7例均符合骨外(髓外)孤立性漿細胞瘤的臨床病理特征，但與一般的漿細胞瘤不同的是所有病例EBER原位雜交檢測均呈陽性。

EBV又稱人類皰疹病毒-4型(human herpesvirus-4, HHV-4)，是一種普遍存在的雙鏈DNA病毒，主要感染人口咽上皮和淋巴細胞，通過病毒的包膜糖蛋白Gp350與B淋巴細胞表面的CD21受體結合，優先感染B淋巴細胞[10]。目前，已明確EBV與許多疾病有關，包括上皮和間葉性腫瘤以及淋巴造血系統疾病等，但其發病機制的確切作用尚未完全明了[11]。EBV的生命周期具有原發感染(包括溶解復制階段)和潛伏期雙向性特點：原發感染階段，由于宿主缺乏對病毒的免疫力，病毒可破壞口咽細胞。接下來的幾天和幾周內，細胞免疫和體液免疫得以發展，病毒潛伏在記憶B細胞中，使記憶B細胞成為EBV貯存庫，被病毒感染的細胞便逃避了機體的免疫識別[10]。盡管全球90%以上的人口感染了EBV，但僅有一小部分相關感染會導致腫瘤轉化[10-11]。研究發現EBV血清陽性的健康個體中，受EBV感染的記憶B細胞向漿細胞的終末分化與病毒復制和EBV裂解周期的啟動有關，呈現一種限制性潛伏期模式[2,6,12]。EBER作為EBV編碼的小RNA，屬于EBV的表達產物，在EBV感染的細胞核中以高拷貝數存在，可能參與了抑制細胞凋亡、誘導細胞增殖和腫瘤形成等過程[13]。結合本組分析發現鼻腔鼻竇的漿細胞瘤雖然少見，但發病人群中EBV感染率占31.8%，盡管相關機制尚不明確，推測EBV可能與漿細胞瘤的發生有一定的關系，需要擴大樣本量進行深入探究。

本組7例腫瘤細胞均呈彌漫浸潤，形態上依據漿細胞分化程度呈完整的譜系，即腫瘤細胞從成熟到不成熟形態，甚至呈現間變性或漿母樣特征。本組3例呈間變性特征，1例具有漿母細胞樣形態特點，此外分化較為成熟的2例中也有部分區域散在分布分化較為不成熟的漿細胞。腫瘤增殖指數在2例分化較成熟組分別為10%和20%，在5例分化不成熟組為40%～90%。查閱文獻發現，個別學者亦觀察到EBV陽性漿細胞瘤的形態學特征可表現為漿母細胞性、局灶漿母細胞性或間變性[14]。結合本組病例，發現EBV對腫瘤的形態和增殖活性可造成一定的影響。

鑒別診斷：當EBV陽性漿細胞瘤中存在間變性或漿母細胞樣形態特征時，需與漿母細胞淋巴瘤(plasmablastic lymphoma, PBL)進行鑒別[15]。PBL更易呈EBV陽性(陽性率為60%～75%，發生于口腔黏膜的陽性率接近100%)，同時具有高增殖活性[1]，其形態及免疫表型等諸多特征均與EBV陽性漿細胞瘤極為相似，但兩者臨床治療方案卻截然不同，因此PBL是EBV陽性漿細胞瘤最重要的鑒別點之一。PBL好發于HIV陽性的男性患者，大部分腫瘤細胞類似于B免疫母細胞，目前歸類于大B細胞淋巴瘤范疇。形態學具有較大的變化范圍，從彌漫和鑲嵌排列到顯著的漿細胞性分化，腫瘤細胞具有顯著的異型性、核偏位、胞質豐富、核仁明顯、核分裂象易見，可見凋亡小體等。PBL細胞具有漿細胞表型，表達CD138、CD38、Vs38c、IRF4/MUM1，不表達或弱表達CD20、PAX-5，但與漿細胞瘤不同的是該腫瘤常表達EMA、CD30，不表達CD56，Ki-67增殖指數一般較高(>90%)[1]。遺傳學上MYC基因是在PBL中最早報道的異常基因[16]，也是PBL中最常見的染色體異常(陽性率達49%)[17]。本組有3例Ki-67呈高增殖指數(>70%)，但CD30陰性、CD56陽性，C-myc基因斷裂重組檢測均為陰性，不符合PBL的特點，盡管形態存在間變性或漿母細胞樣的特點，最終診斷為EBV陽性漿細胞腫瘤，伴有間變性或漿母細胞樣形態特征。另一方面當腫瘤細胞形態學呈現分化較為成熟以及伴有Ki-67低增殖指數時，需進一步與低級別的結外邊緣區黏膜相關淋巴組織淋巴瘤伴廣泛的漿樣分化以及漿細胞單克隆性增殖鑒別[18-19]。因此，外檢中如果發現漿細胞瘤存在間變性或漿母細胞樣特征時，需考慮EBV感染的可能性，同時還要充分的詢問患者是否存在免疫抑制治療、器官或組織移植等病史[4]。

7例患者6例獲得隨訪資料，1例失訪，隨訪時間2.7～40個月，至今均存活，其中4例術后進行了放療，1例進行細胞免疫治療，1例未進行治療。有研究報道，EBER陽性患者預后良好，無侵襲性臨床病程，但與EBER陰性患者相比，EBER陽性患者更容易出現疾病進展(復發/進展為多發性骨髓瘤)[5]，由于目前所觀察的樣本較小，該結論仍需進一步探討。

EBV的存在對腫瘤的形態和增殖活性具有一定的影響，但對該疾病發病機制和發展的影響仍需進一步觀察，有待大樣本數據的薈萃分析，建議病理醫師在今后的外檢工作中增加漿細胞腫瘤EBV的檢測，為進一步認識該腫瘤的生物學行為儲備病例資料。