p16/Ki-67手工染色與全自動免疫組化儀染色效果對比

高麗麗，李 青

p16蛋白是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，p16在細胞周期的阻滯期具有抑制細胞增殖的功能[1]。Ki-67表示細胞周期進展及增殖活躍[2]。兩者同時表達在一個細胞周期則提示細胞周期失調。正常生理狀態下，p16和Ki-67的表達相互制約，不會同時表達于一個細胞中。若p16/Ki-67免疫細胞化學雙染檢測陽性，提示子宮頸上皮內病變2級(cervical intraepithelial neoplasias 2, CIN2)及以上病變[3-6]。Van等[7]提出p16與Ki-67免疫組化雙染可獨立于形態學找及癌細胞。Ikenberg等[8]同樣發現，在子宮頸高級別上皮內病變中p16/Ki-67免疫組化雙染法比細胞學檢查具有更高的靈敏度。近年，越來越多的實驗室應用全自動免疫組化儀進行p16/Ki-67雙染，但手工染色仍占多數。本實驗分別進行p16/Ki-67手工染色和全自動免疫組化儀雙染，比較染色效果，優化染色流程，最終達到良好的染色結果，現介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集2021年1～3月上海市浦東新區人民醫院存檔的子宮頸活檢標本35例，其中子宮頸慢性炎15例，低級別鱗狀上皮內病變(low squamous intraepithelial lesion, LSIL)9例，高級別鱗狀上皮內病變(high squamous intraepithelial lesion, HSIL)9例，鱗狀細胞癌2例。病理診斷均經兩名經驗豐富的病理醫師分別閱片后共同確診。組織均經固定、脫水、包埋和切片后待用。

1.2 主要試劑及儀器p16(SD390兔抗)/Ki-67(MIB1鼠抗)檢測試劑盒(手工)購自廣州深達公司。BOND聚合物檢測系統DS9800/DS9390購自德國Leica公司。全自動免疫組化染色均在Leica BOND MAX全自動免疫組化儀上操作。

1.3 手工染色流程(1)烤片：60 ℃ 1～2 h。(2)脫蠟水化：將組織切片依次置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各5 min，無水乙醇Ⅰ 1 min，無水乙醇Ⅱ、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇各30 s，雙蒸水沖洗30 s。(3)抗原修復：pH 9.0的EDTA修復液高溫高壓修復2 min，自然冷卻至室溫。(4)阻斷內源性過氧化物酶：室溫孵育5 min，PBS沖洗30 s。(5)一抗孵育：p16/Ki-67抗體室溫孵育30 min，PBS沖洗。(6)二抗孵育：HRP/AP聚合物室溫孵育20 min，PBS沖洗。(7)Fast-red顯色：Fast-red顯色液(試劑A-Fast-red底物和試劑B-Fast-red底物緩沖液按1 ∶9比例配置)，室溫顯色20～30 min(鏡下觀察適當調整染色時間)，PBS沖洗終止顯色。(8)DAB顯色：DAB顯色液(染色液B-DAB和A-DAB底物緩沖液按1 ∶20比例混勻)室溫顯色3～5 min(鏡下觀察適當調整染色時間)，雙蒸水沖洗終止顯色。(9)復染：蘇木精染色30～60 s，返藍后流水沖洗干凈。(10)封片：除去玻片上多余液體，添加適量水溶性封片劑(不用加蓋玻片)，45～55 ℃烘箱烘干10～20 min，直至凝固。

1.4 全自動免疫組化儀染色流程采用順次雙染法：抗原修復后進行第一種抗體的染色并顯色，顯色完畢后再進行第二種一抗及第二套顯色系統的染色，最后復染封固(圖1)。

圖1 Leica BOND MAX全自動免疫組化儀p16/Ki-67雙染運行程序

2 結果

細胞內顯示棕色著色為p16陽性，定位于細胞質和細胞核；紅色著色為Ki-67陽性，定位于細胞核，手工染色與全自動免疫組化儀染色結果一致，p16/Ki-67染色鮮明，對比明顯(圖2、3)。在同一細胞中同時存在特異性棕色細胞質和紅色細胞核著色，便視為p16/Ki-67雙染陽性。

圖2 手工染色：子宮頸上皮細胞p16/Ki-67雙染陽性，EnVision兩步法 圖3 全自動免疫組化儀染色：子宮頸上皮細胞p16/Ki-67雙染陽性，EnVision兩步法

3 討論

邱曉陽等[9]研究發現，p16/Ki-67雙染檢測對于鑒別子宮頸細胞學陰性且高危型人乳頭狀瘤病毒陽性而TCT陰性的子宮頸上皮內病變2/3級具有較高的靈敏度和特異性，對于組織學為低級別鱗狀上皮內病變的患者轉歸同樣具有預測價值。潘思瓊等[10]研究表明，p16/Ki-67免疫組化雙染也彌補了TCT中主觀因素導致的漏診及誤診。p16/Ki-67雙染作為子宮頸癌的新興篩查技術，判讀清晰明確，可減輕診斷醫師的閱片負擔；與Ki-67、p16單染效果相比，雙染更加節省玻片、試劑，染色更高效；檢測無需特殊儀器，可降低科室成本，適合在各級醫院開展，尤其是手工染色更適用于欠發達地區。

因此，本實驗旨在探討p16/Ki-67手工染色和全自動免疫組化儀雙染效果，分析兩種染色結果的一致性。實驗發現p16/Ki-67雙染試劑盒手工染色與全自動免疫組化儀染色效果一致性高，均適合p16/Ki-67雙染。手工染色實驗體會如下：(1)堿性修復選擇染色通用性更高的堿性修復方式。(2)Fast-red顯色液和DAB顯色液應現配現用。(3)染色結束后，切記玻片不能接觸乙醇，乙醇可使顯色劑溶解，導致染色失敗。(4)封片劑為水溶性，無需加蓋玻片。(5)染色順序需考慮到Ki-67為胞核染色而p16為胞質、胞核均著色，為避免p16先在胞核中著色形成的顯色物質對后續染色影響，將Ki-67先于p16進行染色。

綜上所述，p16/Ki-67免疫組化雙染技術在病理診斷中尤為重要，一些基層醫院無法開展全自動免疫組化染色，手工染色可以達到同樣的效果；全自動免疫組化儀操作也需與其他實驗方法對比，制定出適合本實驗室最優的染色流程，從而為臨床診斷提供可靠的結果。