不同實(shí)驗(yàn)器皿對(duì)Gomori六胺銀染色的影響

徐圓圓，朱憶凌

隨著抗生素、糖皮質(zhì)激素、化療藥物、免疫抑制劑等藥物種類的不斷增多及藥物應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，極大地降低了患者的免疫力，使得真菌感染的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[1-3]。臨床上，真菌感染缺乏特征性的影像學(xué)表現(xiàn)，并且在顯微鏡下無法直接觀察，特殊染色可提高對(duì)其觀察的特異性和敏感性[4]。Gomori六胺銀染色是將真菌內(nèi)部的黏多糖化合物經(jīng)氧化后暴露并釋放出醛基，醛基將六胺銀液還原成金屬銀，在黑色金屬銀顯現(xiàn)的過程中能完整保存真菌菌絲及孢子的形態(tài)，易于觀察和分辨[5-7]。六胺銀染色操作便捷、圖像顯示清晰，已逐漸成為鑒別真菌的經(jīng)典方法，對(duì)真菌感染的診斷具有客觀直接的意義。在實(shí)際工作中，六胺銀染色效果受到多種因素的干擾，染色缸的清潔是干擾因素之一，染色缸若清潔不徹底，使得過多的銀離子吸附在缸體表面而非病理組織切片上，影響染色顯像的實(shí)際效果。本實(shí)驗(yàn)擬使用3種不同器皿對(duì)真菌進(jìn)行六胺銀染色，以比較其優(yōu)劣。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象選取2019～2020年麗水市中心醫(yī)院病理科收集的20例真菌感染組織，其中曲霉菌9例(45%)，放線菌3例(15%)，隱球菌2例(10%)，孢子絲菌2例(10%)，毛霉菌2例(10%)，其他未知菌種2例(10%)。真菌感染組織均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，脫水，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。每例真菌感染組織均切片3張以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.2 分組將實(shí)驗(yàn)分為3組，以實(shí)驗(yàn)器皿的不同進(jìn)行劃分：A組為使用病理切片盒進(jìn)行后續(xù)染色；B組為使用化學(xué)潔凈玻璃染色缸進(jìn)行后續(xù)染色；C組為使用未經(jīng)清洗、消毒的玻璃染色缸進(jìn)行后續(xù)染色。每組染色20張切片。

1.3 方法

1.3.1試劑及配置 六胺銀染色試劑盒(六胺銀法)購(gòu)自賽諾特生物公司。鉻鹽清洗液配置：在1 000 mL蒸餾水中加入120 g重鉻酸鉀，將200 mL濃硫酸緩慢加入混合液中，待混合均勻后避光保存。病理切片盒購(gòu)自上海世澤生物公司，其主要成分是透明聚丙烯。

1.3.2實(shí)驗(yàn)過程 (1)清洗：將B組待用玻璃染色缸在鉻鹽清洗液中浸泡20 min，流水沖洗5 min，蒸餾水沖洗2 min，烘干后備用。C組玻璃染色缸僅以蒸餾水沖洗5 min，甩干備用。(2)染色：將處理后的病理組織切片放入1%碘酸鈉水溶液中15 min，流水洗滌5 min，蒸餾水沖洗2 min，之后在65 ℃水浴箱中將病理組織切片浸入六胺銀貯備液中20～30 min，組織切片外觀將呈黃褐色，之后將病理組織切片蒸餾水沖洗30 s，0.1%氯化金水溶液調(diào)色1～2 min，海波液定影1 min，水流沖洗5 min，后乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹脂封固，鏡下即可查見黑褐色真菌。三組病理組織切片的染色過程相同，僅染色容器有所不同。每組染色20張切片，操作總時(shí)間取平均值。

1.4 評(píng)估指標(biāo)及內(nèi)容(1)比較三組染色過程中鏡下真菌染色的著色力度，菌絲和孢子顏色、形態(tài)和清晰度，來比較不同器皿六胺銀真菌染色的差異。(2)由兩名副主任醫(yī)師對(duì)60張切片染色效果進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分從背景清晰度、切片菌絲形態(tài)清晰度、著色力度、染色力度幾個(gè)層面進(jìn)行，最高分為10分。(3)比較三組切片染色操作總時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 A組染色情況A組使用病理切片盒作為染色器皿，染色20～25 min時(shí)可觀察到真菌被著色且著色力度強(qiáng)，銀顆粒在器皿壁附著較少(圖1)，染色背景清晰，可清晰地觀察到黑褐色菌絲和孢子，形態(tài)可辨(圖2)；染色30 min時(shí)出現(xiàn)銀鏡反應(yīng)，著色過深，背景顏色亦過深，無法辨認(rèn)。

圖1 組織切片在病理切片盒中染色20～25 min后，銀顆粒吸附表現(xiàn) 圖2 組織切片在病理切片盒中染色20～25 min后鏡下表現(xiàn) 圖3 組織切片在化學(xué)潔凈缸中染色20～25 min后，銀顆粒吸附表現(xiàn) 圖4 組織切片在化學(xué)潔凈缸染色中染色20～25 min后鏡下表現(xiàn) 圖5 組織切片在未經(jīng)清洗、消毒的玻璃染色缸中染色20～25 min，銀顆粒吸附表現(xiàn) 圖6 組織切片在未經(jīng)清洗、消毒的玻璃染色缸中染色25 min后鏡下表現(xiàn)

2.2 B組染色情況B組使用化學(xué)潔凈玻璃染色缸作為染色器皿，染色20～25 min(圖4)、30 min的表現(xiàn)與A組相近，唯一不同點(diǎn)是，染色缸壁吸附少量銀顆粒，玻璃壁吸附銀離子呈淺黃色(圖3)。

2.3 C組染色情況C組采用未經(jīng)清洗、消毒的玻璃染色缸作為染色器皿，染色20～25 min后鏡下觀察切片上色不清晰，著色力度不佳，背景呈現(xiàn)模糊淺褐色(圖6)，玻璃壁吸附較多銀離子，呈黃色(圖5)；染色30 min時(shí)出現(xiàn)銀鏡反應(yīng)，背景因缸壁吸附過多銀離子而變得不清晰，菌絲與孢子著色過深無法辨認(rèn)。

2.4 染色總操作時(shí)間從器皿清洗到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，A組操作總時(shí)間為(61±1.357) min，C組操作總時(shí)間為(60.75±0.716) min，兩組操作時(shí)間相比差異無顯著性(t=0.729，P=0.213)；B組操作總時(shí)間為(83.3±1.625) min，與A組相比差異有顯著性(t=47.095，P<0.001)，與C組相比差異有顯著性(t=56.773，P<0.001)。

2.5 切片染色評(píng)分與診斷準(zhǔn)確率A組切片染色評(píng)分與B組相比差異無顯著性(P>0.05)，與C組相比差異有顯著性(t=15.565，P<0.05)。A組切片的診斷準(zhǔn)確率(100.0%)與B組(95.0)相比差異無顯著性(χ2=1.026，P=0.311)，但與C組(50.0%)相比差異有顯著性(χ2=13.333，P<0.001，表1)。

表1 不同分組切片染色評(píng)分與診斷準(zhǔn)確率對(duì)比[n(%)]

3 討論

真菌感染病例的臨床表現(xiàn)、病理特征、影像學(xué)表現(xiàn)方面均缺乏特異性，存在較高的漏診、誤診率。臨床醫(yī)師需依賴病理診斷了解致病菌群，以采取針對(duì)性治療。在病理學(xué)上，通過六胺銀對(duì)菌體進(jìn)行組織化學(xué)染色，將真菌內(nèi)部的多糖氧化后，利用暴露的醛基還原六胺銀溶液中的黑色金屬銀，使得菌體黑染，是觀察真菌形態(tài)的最佳方法之一。

在實(shí)驗(yàn)中，六胺銀染色效果受諸多因素的影響，其中實(shí)驗(yàn)器皿的選擇至關(guān)重要。在溫水浴中，銀氨液被醛基還原為銀，因物理吸附可不斷被吸附于玻璃壁上。不潔染色缸壁上有大量蛋白、糖、脂肪等，除物理吸附，同時(shí)還進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，溶液中的Ag+被消耗，過多的吸附于缸壁，而使得病理組織切片上Ag+吸附過少，降低真菌組織的著色程度，甚至過早出現(xiàn)銀鏡反應(yīng)，導(dǎo)致染色失敗。以往文獻(xiàn)中亦未報(bào)道可用于六胺銀染色的最佳實(shí)驗(yàn)器皿，以往使用的實(shí)驗(yàn)器皿均需使用強(qiáng)氧化性和腐蝕性的鉻鹽清洗液浸泡清洗才可用于實(shí)驗(yàn)，所以尋求一種安全有效方便的實(shí)驗(yàn)器皿具有十分重要的意義。作者在工作中首次發(fā)現(xiàn)，常規(guī)使用的病理切片盒對(duì)銀顆粒的吸附力遠(yuǎn)比玻璃缸弱，無需清洗即可達(dá)到較好的實(shí)驗(yàn)效果，且切片盒大小合適，成本低、易購(gòu)買。其做為實(shí)驗(yàn)器皿，應(yīng)用于Gomori六胺銀染色中，簡(jiǎn)便易行，染色效果佳。本實(shí)驗(yàn)將病理切片盒的染色效果與化學(xué)潔凈玻璃染色缸、非潔凈玻璃染色缸進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果顯示，使用病理切片盒作為染色器皿，與化學(xué)潔凈玻璃染色缸具有相同的染色效果，在染色20～25 min時(shí)可呈現(xiàn)較好的真菌染色著色力度，菌絲、孢子形態(tài)可辨，且背景清晰。化學(xué)潔凈玻璃缸在使用時(shí)玻璃缸壁也會(huì)呈現(xiàn)淺黃色，另一組非潔凈的玻璃染色缸，實(shí)驗(yàn)效果欠佳，此實(shí)驗(yàn)證明六胺銀染色對(duì)實(shí)驗(yàn)器皿較為敏感。一直用于清洗玻璃器皿的清洗液通常由濃硫酸、高錳酸鉀配置，具有強(qiáng)烈的腐蝕性、氧化性，對(duì)人體可造成潛在危害性，在采購(gòu)、運(yùn)輸、使用、廢棄等環(huán)節(jié)中均存在不便性。相比玻璃器皿，使用病理切片盒無需考慮清洗液等諸多不便環(huán)節(jié)，且染色效果更佳。

六胺銀染色法對(duì)真菌的鑒別力度高，已成為鑒別真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。常規(guī)染色過程耗時(shí)長(zhǎng)，需2～3 h，且前期器皿清潔與試劑配制繁瑣、穩(wěn)定性低，影響檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，使用病理切片盒進(jìn)行染色，與未潔凈的玻璃缸染色時(shí)間相當(dāng)，染色效果與使用潔凈玻璃缸相同。這提示病理切片盒聯(lián)合六胺銀試劑盒，可大幅減少操作時(shí)間，且染色結(jié)果穩(wěn)定，效果良好，可避免多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

本實(shí)驗(yàn)采用了3種不同的實(shí)驗(yàn)器皿進(jìn)行六胺銀染色，結(jié)果顯示在病理切片盒中進(jìn)行六胺銀染色表現(xiàn)最佳，染色效果好，操作時(shí)間短，是最優(yōu)選的實(shí)驗(yàn)器皿。