擬南芥鈣依賴蛋白激酶CPK11與ABA響應元件結合因子ABF4相互作用的研究

胡 搏, 劉盈盈, 楊 毅

(四川大學生命科學學院 生物資源與生態環境教育部重點實驗室， 成都 610065)

鈣離子(Ca2+)是細胞內的第二信使,鈣離子轉運蛋白的EF-hand結構可以結合Ca2+從而傳遞鈣信號[1].鈣依賴蛋白激酶CPKs是一類含有絲氨酸/蘇氨酸激酶域的蛋白質,是植物中必不可少的鈣信號感受器.CPKs在大豆中被第一次發現[2].擬南芥中CPKs家族共有34個成員[3],各成員中具有保守的結構域,分別包括：N端可變域、絲氨酸/蘇氨酸激酶域、自抑制域和類鈣調素結合域[4].CPKs在植物體內的功能主要體現在能夠參與激素相關的反應,如CPKs能夠參與植物激素脫落酸ABA信號轉導過程[5].此外,CPKs還能調控植物生長發育過程.如CPK32可以調節植物的開花時間等[6].CPK11和CPK24可以共同調節擬南芥花粉管中鉀離子通道[7].CPK2和CPK20也能調控花粉管生長[8].

利用酵母雙雜交實驗證明部分鈣依賴蛋白激酶與堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子(basic leucine zipper,bZIP)家族亞組ABFs存在相互作用[9].分析ABFs的過表達和突變體株系的表型可證明其在ABA信號通路以及非生物脅迫下扮演重要角色[10].說明鈣依賴蛋白激酶可以通過與ABFs相互作用參與到ABA信號通路中.擬南芥中ABFs有4個成員,分別是ABF1、ABF2、ABF3和ABF4. ABFs家族成員都具有5個保守序列,分別為N端的C1、C2、C3和一個結合DNA序列的bZIP區域以及C4[11].保守序列中均含有R-X-X-S/T,能夠被CPKs和蔗糖非酵解型蛋白激酶2(Sucrose non-fermenting-1 related protein kinase 2,SnRK2)磷酸化,從而激活ABFs的轉錄活性[12].如CPK4和CPK11能夠通過磷酸化方式激活ABF1和ABF4[13].CPK32可以和ABF4發生相互作用并且磷酸化ABF4進而調控ABA信號通路相關基因的表達[14].CPK12可以和ABF4發生相互作用,也可以與ABI2相互作用影響擬南芥種子萌發以及幼苗生長[15].

CPK11能夠正向調控ABA信號通路,也能夠體外磷酸化ABF4[13],因而CPK11可能通過磷酸化ABF4從而影響ABA信號轉導.但是CPK11能否與ABF4在植物體內發生直接相互作用進而參與到ABA信號通路中還未見報道.本文通過體外酵母雙雜實驗以及體內雙分子熒光互補實驗對CPK11與ABF4蛋白之間的直接相互作用提供了實驗依據,對CPKs參與ABA信號通路的分子機制的研究具有補充和豐富的作用,為后續研究植物參與ABA信號通路以及抵御逆境脅迫提供理論和實驗支持.

2 材料與方法

2.1 材 料

植物材料擬南芥哥倫比亞野生型Columbia(Col-0)種子由實驗室密封常溫保存.

實驗中使用到的菌株大腸桿菌菌株(Escherichiacoli)、農桿菌菌株(AgrobacteriumStrain)、酵母菌株(Saccharomycescerevisiae),所使用的載體pGADT7、pGBKT7、pSPYNE、pSPYCE均由本實驗室于-80 ℃長期保存.

Primestar MAX DNA高保真酶購于諾唯贊公司.dNTPs及反轉錄試劑盒購于Takara公司.T4 DNA連接酶、同源重組酶、限制性內切酶購于Thermo公司.膠回收純化試劑盒、質粒小提試劑盒購于北京天根公司.營養缺陷型培養基購于泛基諾科技公司.引物合成以及測序由華大基因公司以及擎科和有康生物科技有限公司完成.

2.2 方 法

2.2.1 目的基因的獲取以及載體的構建 從野生型擬南芥中提取總RNA, 通過反轉錄合成cDNA,詳細步驟參考反轉錄試劑盒說明書.以合成的cDNA為模板,通過設計的特異性的引物(表1)從模板中擴增出所需的目的片段.擴增目的片段所用酶為Primestar DNA高保真酶,擴增程序為DNA變性、退火以及延伸,設置的溫度和時間分別為97 ℃15 s、57 ℃15 s以及72 ℃10 s,擴增循環數為34.PCR擴增產物通過瓊脂糖凝泳電泳檢測目的片段分子大小正確后利用膠回收試劑盒回收純化目的片段,即獲得所需的目的基因CPK4、CPK11以及ABF4.

將目的片段和質粒利用限制性內切酶分別酶切,具體酶切位點見表1.T4 DNA連接酶連接目的片段和質粒的酶切產物,后將連接產物轉入大腸桿菌感受態.接著將轉入重組質粒的大腸桿菌感受態按照質粒所攜帶的抗性基因分別涂布于卡那和氨芐抗性培養基上過夜培養.利用菌落PCR技術從抗性培養基上篩選陽性克隆菌落.得到的陽性克隆菌在LB液體培養基中擴大培養后,利用質粒小提試劑盒按試劑盒說明書提取重組質粒pGADT7-ABF4、pGBKT7-CPK11、pSPYNE-CPK11、pSPYNE-CPK4、pSPYCE-ABF4.其中pSPYCE-ABF4重組質粒構建過程中除利用同源重組連接目的片段與載體外其他操作過程同上.最后將獲得的重組質粒送擎科以及有康生物科技公司測序.

表1 實驗所用引物

2.2.2 氨基酸序列比對及進化樹構建 CPK11的氨基酸序列下載于Tair網站,即Arabidopsis Information Resource database(http://www.arabidopsis.org/),CPK11在擬南芥中的同源氨基酸序列下載自NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).CPK11的氨基酸序列二級結構用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/show_motifs.pl)網站預測,利用IBS軟件制作蛋白質二級結構域.不同CPKs之間的氨基酸序列的比對利用DNAMAN軟件.進化樹的構建利用MEGA7.0軟件，構建進化樹時選擇Neighbor-joining鄰接法,設置步長值為1000，模型用Kimura 2-parameter Model，缺失數據處理選擇部分缺失，完整度設置參數為95.

2.2.3 酵母雙雜交實驗 根據酵母雙雜交實驗步驟(Clontech), 利用AH109酵母菌株制備酵母感受態,將重組質粒AD-ABF4+BD-CPK11共轉進感受態酵母中作為實驗組,實驗室保存的AD-CARK3+BD-RCAR12質粒轉入酵母感受態作為陽性對照組,轉入AD-ABF4+BD以及AD+BD-CPK11重組質粒的酵母感受態作為陰性對照.吸取5 μL酵母菌液滴于氨基酸營養缺陷型固體培養基SD/-Trp-Leu上于30 ℃培養箱中生長2～3 d,并且通過菌落pcr鑒定為陽性菌落,說明共轉體系正確.之后將陽性單克隆接種在SD/-Trp-Leu液體培養基中30 ℃,220 r/min振蕩培養48 h,用生理鹽水將樣品OD600調至相同.此后將樣品分別稀釋10倍,100倍,1000倍后取5 μL滴于SD/-Trp-Leu和SD/-Trp-Leu-His固體培養基上,30 ℃培養4～6 d觀察實驗結果.

2.2.4 雙分子熒光互補實驗 根據雙分子熒光互補實驗步驟(Lee)[16],將陽性對照NE-CARK3+CE-RCAR12,陰性對照組NE-CPK11/CPK4+CE以及NE+CE-ABF4和實驗組NE-CPK11/CPK4+CE-ABF4分別轉進農桿菌感受態中,隨后涂布于含有卡那、慶大、利福平三種抗生素的YEP固體培養基上生長兩天.挑取經過鑒定的陽性克隆菌落于含有卡那、慶大、利福平三種抗生素的YEP液體培養基中28 ℃,220 r/min振蕩過夜培養.取菌液低速離心得到沉淀的菌體后,用浸染液重懸菌體,再次4000 r/min離心10 min,重復以上步驟幾次后,用浸染液重懸菌體.溶液OD600的值在0.8附近時,將溶液靜止避光2 h后,等量混合,用注射器將含有不同質粒的混合農桿菌液一次性注射到煙草葉片中,48 h后利用激光共聚焦顯微鏡在一定波長的激發光下觀察正負對照組以及實驗組的熒光情況.

3 結果分析

3.1 CPK11與同源蛋白氨基酸序列比對及親緣關系分析

擬南芥中CPK11的氨基酸序列下載自TAIR網站,利用SMART網站預測擬南芥CPK11蛋白質二級結構.CPK11共有495個氨基酸,其中從第26到第284個氨基酸為CPK11的蛋白激酶結構域,并且包含了4個EF-hand域(圖1a).利用NCBI網站下載了擬南芥中與CPK11屬于同一亞家族的CPK4和CPK6.利用DNAMAN軟件比對上述CPKs與CPK11氨基酸序列.根據比對結果可知CPK6與CPK11氨基酸序列的相似度為68%,CPK4與CPK11氨基酸序列相似度達95%(圖1b).

通過MEGA軟件分析擬南芥CPK11與其他鈣依賴蛋白激酶CPK1、CPK2、CPK4、CPK5、CPK6、CPK12、CPK20、CPK26的親緣關系,發現CPK11與其他CPKs親緣關系由近及遠依次為CPK4、CPK12、CPK26、CPK6、CPK5、CPK20、CPK2、CPK1(圖1c),其中CPK4與CPK11親緣關系最近.結合序列比對與親緣關系分析可知CPK4是與CPK11高度同源的蛋白質.以上結果為研究CPK11同源蛋白的功能提供了相關的理論依據,為后續實驗中開展該同源蛋白相關實驗研究提供理論支持.

圖1 CPK11蛋白質二級結構(a)同源氨基酸序列比對(b)及不同CPKs進化關系分析(c)

3.2 酵母雙雜交實驗驗證CPK11與ABF4體外相互作用

為了探究CPK11與ABF4是否存在體外相互作用,我們利用酵母雙雜交實驗進行驗證.首先將構建成功的載體共轉入酵母感受態5 d左右觀察酵母在二缺固體培養基(SD/-Leu-Trp)以及三缺固體培養基上(SD/-Leu-Trp-His)的生長情況.觀察酵母生長情況可以發現陽性對照組AD-CARK3+BD-RCAR12、陰性對照組AD-ABF4+BD、AD+BD-CPK11和實驗組AD-ABF4+BD-CPK11均能在二缺培養基上長出丘狀隆起,顏色呈乳白色的酵母菌落(圖2左),說明實驗體系以及操作正確.觀察酵母生長情況發現共轉AD+BD-CPK11的酵母感受態在三缺培養基上長出白色菌落,說明BD-CPK11具有自激活現象,故在三缺培養基中加入0.5 mmol/L的3AT抑制此現象.加入3AT的三缺培養基中陽性對照組以及共轉CPK11與ABF4的實驗組能夠長出乳白色酵母菌落,并且隨著稀釋倍數的增大酵母菌落逐漸減少,而陰性對照組未長出酵母菌落(圖2右),證明CPK11與ABF4兩者之間存在體外相互作用.

圖2 酵母雙雜交實驗檢測CPK11與ABF4體外互作

CPK11與ABF4除存在體外相互作用外,是否也存在體內相互作用?為了驗證這一猜想我們隨后進行了雙分子熒光互補實驗.將陽性對照組NE-CARK3+CE-RCAR12,陰性對照組NE-CPK11+CE以及NE+CE-ABF4,以及實驗組NE-CPK11+CE-ABF4的農桿菌液注射煙草細胞2 d后,利用共聚焦顯微鏡在激發光下觀察煙草細胞.熒光結果顯示,陽性對照組NE-CARK3+CE-RCAR12產生熒光,而陰性對照組NE-CPK11+CE以及NE+CE-ABF4未產生熒光,說明實驗體系以及操作正確.實驗組NE-CPK11+CE-ABF4在激發光下觀察到熒光,同時定位在細胞核中(圖3),說明CPK11與ABF4存在體內相互作用.

圖3 BiFC驗證CPK11與ABF4體內相互作用

3.4 CPK11同源蛋白CPK4與ABF4的體內相互作用

通過圖1序列比對以及親緣關系分析可知CPK4是與CPK11高度同源的蛋白質.蛋白的結構決定蛋白功能,進化關系相近的蛋白往往也具有相似的功能.因此推測CPK4也有可能與ABF4在植物體內具有直接的相互作用.隨后利用雙分子熒光互補實驗來證明此猜想.BiFC實驗結果顯示:陽性對照組NE-CARK3+CE-RCAR12產生熒光,而陰性對照組NE-CPK4+CE以及NE+CE-ABF4未產生熒光,說明實驗體系正確.實驗組CPK4與ABF4在激光下能夠產生熒光,證明CPK4與ABF4存在體內相互作用,且互作定位在細胞核中(圖4).

圖4 BiFC驗證CPK4與ABF4體內相互作用

植物激素脫落酸ABA在植物生長發育過程中起著關鍵的調節作用,ABA信號網絡已經被逐步闡明[17].通過對ABA信號通路的研究可以明確部分鈣依賴蛋白激酶能夠正向調控ABA信號通路,已知的如CPK4和CPK11[13]以及CPK6[18]. 擬南芥中CPK4、CPK11、CPK6同屬于一個亞家族[3],具有保守的激酶結構域,親緣關系較近(圖1).它們在ABA信號通路中起正調控作用,可以從其蛋白互作底物角度進行闡釋.

之前的文章中報道酵母雙雜交實驗中CPK11與ABF4在四缺固體培養基(SD-Trp-Leu-His-Ade)不表現出直接的相互作用[9,19]. 由于蛋白激酶具有自抑制結構域,猜測可能是CPK11與ABF4的結合位點由于蛋白激酶自抑制結構域的存在而處于出非活性狀態,因而表現出較弱的相互作用.因此,本文在酵母實驗中使用三缺固體培養基(SD-Trp-Leu-His),發現將含有CPK11與ABF4重組質粒的酵母感受態稀釋不同濃度后滴在三缺培養基上能夠長出白色酵母菌落,說明兩者之間存在體外相互作用(圖2),但是相互作用較弱,因此在更加嚴格的篩選條件下兩者之間相互作用不易被檢測到.通過酵母雙雜交實驗證明CPK11與ABF4具有體外相互作用后,本文又通過雙分子熒光互補實驗進一步證明CPK11與ABF4在植物體內也存在相互作用(圖3).同時,本文還證明了CPK11的同源蛋白CPK4可以與ABF4在植物體內發生直接的相互作用(圖4).結合之前的研究報道CPK6可以與正調控因子ABF3以及ABI5相互作用[19],說明CPK家族中CPK4、CPK6、CPK11與鈣離子結合之后通過與不同的正調控因子進行相互作用,從而調控下游ABA信號通路中相關基因的表達,使植物能夠適應環境變化并且迅速作出應答(圖5).

圖5 CPK11及其同源蛋白在ABA信號通路中的工作模型

本文研究CPK11與ABF4的直接相互作用為鈣依賴蛋白激酶家族篩選其潛在底物提供方向,后續可以進一步篩選與CPK11蛋白互作的其他底物.本文對ABA信號通路分子機制的研究具有補充與豐富的作用,為此后研究鈣依賴蛋白激酶家族參與調控植物的生長發育及抵御逆境脅迫提供理論和實驗依據.