黃芪三仙湯抗絕經后骨質疏松作用機制的研究

鄧艷玲，翁文玉，招澤豪，施健新，陳灼均，鄧煜，周志昆

（廣東醫科大學，廣東東莞 523808）

絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是中老年女性常見的代謝性、全身性骨病。婦女絕經后，體內雌激素水平驟然下降，骨形成和骨吸收偶聯失衡，導致骨量減少、骨組織顯微結構破壞，容易發生骨折[1]。隨著人口老齡化，PMOP的防治已成為全球關注的重要問題。本課題組在前期臨床研究中，將黃芪三仙湯分別與尼爾雌醇、鈣爾奇作對照治療PMOP患者，證實了黃芪三仙湯可提高絕經后婦女的雌激素水平，改善骨代謝，增加骨密度[2-3]；動物和細胞實驗結果也發現，該方可提高PMOP大鼠血清中骨鈣素、鈣離子、磷離子等的濃度[4]，可促進成骨細胞（OB）中護骨素和護骨素配體的表達[5]。前期研究結果表明，黃芪三仙湯可有效治療PMOP，但其作用機制仍不完全明確。有研究表明，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路與骨質疏松癥有關[6]。在多種病理生理過程中，PI3K/Akt信號通路在調節細胞增殖、存活和分化中起著至關重要的作用[7-8]。故本研究從PI3K/Akt信號通路出發，在細胞水平探討黃芪三仙湯對PMOP成骨細胞的調控作用，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物黃芪三仙湯，由黃芪、肉蓯蓉、淫羊藿葉、丹參、三七、當歸、延胡索、威靈仙、仙茅等9味中藥組成，各中藥材由東莞國藥公司提供；鹽酸雷洛昔芬片（易維特）由西班牙LILLY，S.A.公司提供，生產批號：C626623。

1.2 試劑與儀器LY294002（美國MCE公司）；細胞計數試劑盒8（CCK-8）（日本同仁公司）；堿性磷酸酶檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；茜素紅（美國Sigma公司）；抗兔磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）1、Akt1、p-Akt2、Akt2、雌激素受體α（ERα）、Runt相關轉錄因子2（Runx2）、骨橋蛋白（OPN）、成骨細胞特異性轉錄因子Osterix（Osx）等抗體（美國Abcam公司）；NBT/BCIP堿性磷酸酶檢測試劑盒（碧云天生物技術有限公司）；Western Blot Marker、顯影劑（碧云天生物技術有限公司）。雙能X線骨密度儀（美國Hologic公司）；顯微鏡（重慶奧特光學儀器有限公司）；多功能酶標儀（美國Bio-Rad公司）；流式細胞儀（美國BD公司）；垂直電泳槽、電泳儀、轉膜槽、轉膜儀、凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）。

1.3 體內研究

1.3.1 實驗動物84只SPF級3月齡雌性未生育的SD大鼠，動物質量合格證號：44005800008198，購自廣州中醫藥大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（粵）2013-0034。所有動物實驗都符合動物實驗指南，符合國際公認的實驗動物使用規定[9]，并獲得廣州中醫藥大學動物倫理委員會的批準。

1.3.2 藥物制備①黃芪三仙湯按黃芪∶淫羊藿葉∶威靈仙∶三七∶延胡索∶丹參∶當歸∶肉蓯蓉∶仙茅=15∶10∶10∶5∶10∶10∶8∶10∶10的比例組成。用蒸餾水煎煮2 h，藥液過篩。反復煎煮2次，4℃儲存。②鹽酸雷洛昔芬混懸液的配制：取60 mg鹽酸雷洛昔芬片磨碎后，加入96 mL雙蒸水，充分溶解，配制成濃度為0.625 mg/mL的雷洛昔芬混懸液。③含LY294002的培養液配制：將5 mg LY294002粉末加入162 μL二甲基亞砜（DMSO）充分溶解備用，使用時，每1 mL培養液加入1 μL配好的LY294002。

1.3.3 動物分組與PMOP動物模型的建立將84只大鼠適應性飼養1周后，隨機分為7組，即正常組，模型組，假手術組，黃芪三仙湯高、中、低劑量組和陽性對照組。除正常組外，其余6組大鼠以異氟烷進行麻醉和消毒。模型組和黃芪三仙湯高、中、低劑量組大鼠從背部兩側切口，結扎并切除雙側卵巢[10]；假手術組進行切除脂肪的假手術，即切除兩側卵巢附近同樣大小的脂肪；正常組不進行任何處理。為了防止感染，每只大鼠在術后3 d內肌肉注射20萬U青霉素。術后常規飼養12周?？筛鶕敲芏群凸墙M織形態學結果判斷是否成功構建去卵巢骨質疏松大鼠模型[11]。

1.3.4 給藥按人與動物用藥等效劑量換算方法[大鼠每天給藥劑量（mg/kg）=人每天給藥劑量（mg）/60 kg×6.25]，計算大鼠的等效給藥量。大鼠常規飼養1周后，黃芪三仙湯高、中、低劑量組大鼠分別給予27.501、9.167、3.056 g/kg的黃芪三仙湯水煎液灌胃；陽性對照組給予雷洛昔芬混懸液6.25 mg/kg灌胃；正常組、假手術組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃。每天1次，10 mL/kg，持續12周。

1.3.5 取材給藥結束后，禁食24 h，處死大鼠，分離股骨，去除附著在股骨上的肌肉。將右側股骨，浸泡于4%福爾馬林溶液中，用于制備骨切片；將左側股骨置于-80℃冰箱中保存，用于測量骨密度。

1.3.6 骨密度的測定應用雙能X線骨密度儀檢測大鼠股骨全段、股骨遠端、股骨近端的骨密度。

1.3.7 股骨石蠟切片制備和蘇木素-伊紅染色檢測骨組織形態學變化取右側股骨，置于4%多聚甲醛溶液中，4℃固定48 h，固定完成后置于EDTA脫鈣液中浸泡脫鈣，每2 d更換1次脫鈣液，直至用針可刺進骨皮質時為脫鈣完成。用刀將股骨從冠面對半切開，制作蠟塊、切片。將切片進行烤片、脫蠟至水、蘇木素染色、分色、伊紅染色、梯度酒精脫水后，用二甲苯透明5 min×2次，中性樹膠封片。最后置于顯微鏡下（×20）觀察拍照，用Image-Pro Plus 6.0軟件計算骨小梁數目（Tb.N）、骨小梁面積百分比（Tb.Ar%）和骨小梁分離度（Tb.Sp）。

1.3.8 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測股骨組織p-Akt1、Akt1、p-Akt2、Akt2、ERα蛋白表達將儲存備用的股骨取出，剪掉股骨遠端骨組織，并置于裝有裂解液的預冷研缽中，向研缽中加入液氮，研磨至看不見顆粒狀骨組織，離心取上清液并測定濃度（具體步驟參照BCA試劑盒說明書）。然后加入5×Buffer的上樣緩沖液，混勻，離心，95℃變性5 min，根據BCA法測出的結果，分別計算出各樣品含30 μg蛋白的溶液體積，確定蛋白上樣量進行上樣。以70 V恒壓電泳約30 min，當溴酚藍條帶進入分離膠后，將電離分離儀電壓調至90 V，以90 V恒定電壓電泳90 min后，進行轉膜（轉膜儀電流調至300 mA，恒流轉膜90 min）。轉膜結束后，對照Marker分子量參照表，切出需要的PVDF膜條帶，轉移至50 g/L脫脂奶粉的洗膜槽中，封閉90 min，加入稀釋比為1∶1 000的p-Akt1、Akt1、p-Akt2、Akt2、ERα等一抗4℃孵育過夜。TBST溶液漂洗3次，將條帶置于稀釋比為1∶1 000的羊抗兔、羊抗鼠混合二抗溶液中，在搖床上室溫孵育60 min，用TBST沖洗3次，加入顯影劑，用凝膠成像系統進行顯影。最后應用ImageJ軟件測量所有波段的光密度（OD）值。

1.4 體外研究

1.4.1 含藥血清的制備和原代PMOP成骨細胞的培養42只3月齡雌性SD大鼠，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，動物質量合格證號：44005800008198。大鼠適應性喂養1周后，隨機分為3組，包括正常血清組、黃芪三仙湯血清組和雷洛昔芬血清組，每組14只。按照人與動物用藥等效劑量換算方法計算各組大鼠的等效給藥量。黃芪三仙湯血清組大鼠給予9.167 g/kg黃芪三仙湯灌胃，雷洛昔芬血清組大鼠給予6.25 mg/kg雷洛昔芬混懸液灌胃，正常血清組大鼠給予生理鹽水10 mL/kg灌胃，給藥1周。最后一次灌胃后1 h，麻醉大鼠，心臟穿刺采集血樣，離心獲得血清樣品，水浴滅活，過濾，-80℃儲存。

參考文獻研究[12]，從模型組大鼠的顱骨獲得原代PMOP成骨細胞。

1.4.2 CCK-8法檢測PMOP成骨細胞的增殖活力將PMOP成骨細胞以密度7×103個/孔接種于96孔培養板中，細胞黏附后，在無血清ɑ-MEM培養基中培養24 h。饑餓處理后，吸棄原始培養基，分別添加濃度為2.5%、5%、10%、15%、20%（v/v）的正常血清、黃芪三仙湯血清、雷洛昔芬血清孵育細胞72 h后，吸棄原始培養基，添加10%CCK-8培養基孵育2 h。最后，用酶標儀測量450 nm波長處的OD值，以評估不同血清濃度對PMOP成骨細胞增殖活力的影響。

在后續細胞增殖實驗中，種板和饑餓處理后，分別添加含20%正常血清、黃芪三仙湯血清和雷洛昔芬血清的培養液培養細胞24、48、72 h，添加10%CCK-8培養基，測量OD值，以評估不同處理時間對PMOP成骨細胞增殖活力的影響。

1.4.3 堿性磷酸酶活性的測定將PMOP成骨細胞以密度為2×104個/孔接種到24孔板中。細胞黏附后，在無血清ɑ-MEM培養基中培養24 h。饑餓處理后，吸棄原始培養基，分別加入含有20%正常血清、20%雷洛昔芬血清、20%黃芪三仙湯血清、20%黃芪三仙湯血清+10 μmol/L LY294002抑制劑的培養液，培養3 d后，按照堿性磷酸酶檢測試劑盒說明書方法檢測堿性磷酸酶活性。方法：采用70%乙醇固定細胞15 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，37℃用NBT/BCIP堿性磷酸酶染色緩沖液孵育30 min，最后風干并在顯微鏡下觀察、拍片。

1.4.4 礦化分析將PMOP成骨細胞以密度為2×104個/孔接種在24孔板中。細胞黏附后，在無血清α-MEM培養基中培養24 h。饑餓處理后，吸棄原始培養基，分別加入含有20%正常血清、雷洛昔芬血清、黃芪三仙湯血清的培養液孵育細胞3 d。礦化分析：PBS洗滌細胞后，70%乙醇固定15 min，然后用超純水洗滌，并于37℃用5.0 g/L茜素紅孵育30 min，最后除去超純水，自然風干并在顯微鏡下觀察拍片。為了定量基質礦化和鈣沉積，將茜素紅染色劑充分溶解于氯化十六烷基吡啶（CPC）的10%水合物溶液中，振蕩30 min，然后將溶解的染色劑放入96孔板中，應用酶標儀測量562 nm波長處的OD值。

1.4.5 Western Blot法檢測PMOP成骨細胞p-Akt1/Akt1、p-Akt2/Akt2、ERα、Runx2、OPN、Osx

蛋白的表達將PMOP成骨細胞以密度2×105個/孔添加至6孔板中。細胞黏附后，在無血清α-MEM培養基中培養24 h。饑餓處理后，吸棄原始培養基，并加入含20%正常血清、20%雷洛昔芬血清、20%黃芪三仙湯血清、20%黃芪三仙湯血清+10 μmol/L LY294002的培養液孵育細胞3 d，提取細胞總蛋白。下一步操作方法參考“1.3.8”項下。

1.5 統計方法采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。進一步兩兩比較，若方差齊則采用LSD檢驗，若方差不齊則采用Tamhane’s T2檢驗。以P＜0.05為差異統計學意義。

2 結果

2.1 黃芪三仙湯對PMOP大鼠股骨骨密度的影響圖1結果顯示：與正常組和假手術組比較，模型組大鼠股骨各段的骨密度均顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，雷洛昔芬組的股骨全段、股骨遠端、股骨近端的骨密度均明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪三仙湯高、中劑量組股骨遠端、股骨近端的骨密度均明顯增加（P＜0.05），股骨全段的差異無統計學意義（P＞0.05），黃芪三仙湯低劑量組股骨遠端的骨密度明顯增加（P＜0.05），股骨全段和股骨近端的差異無統計學意義（P＞0.05）。表明絕經后骨質疏松大鼠造模成功，黃芪三仙湯可有效改善去卵巢骨質疏松大鼠骨密度，且呈劑量依賴性。

圖1 各組大鼠骨密度比較Figure 1 Comparison of bone mineral density（BMD）in various groups of rats

2.2 黃芪三仙湯對PMOP大鼠股骨遠端骨組織形態學、計量學的影響圖2-A結果顯示：正常組、假手術組的骨小梁排列緊密，結構完整；模型組骨小梁斷裂、缺失嚴重，骨髓腔中出現大量空腔，表現出明顯的骨丟失。與模型組比較，雷洛昔芬組的骨小梁斷裂、缺失情況得到了明顯的改善，骨小梁排列緊密，結構相對完整，而黃芪三仙湯各劑量組的骨小梁斷裂、缺失情況也均有所改善，且效果呈一定的劑量依賴性，其中，黃芪三仙湯低劑量組仍存在較為嚴重的骨小梁斷裂、缺失，黃芪三仙湯中劑量組有部分骨小梁缺失、斷裂，黃芪三仙湯高劑量組骨小梁只有少部分缺失或斷裂。

圖2-B結果顯示：模型組大鼠的骨小梁數量較正常組、假手術組均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，雷洛昔芬組和黃芪三仙湯高劑量組的骨小梁數量均顯著增加（P＜0.05），黃芪三仙湯中、低劑量組的差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖2-C結果顯示：模型組大鼠的骨小梁面積百分比較正常組、假手術組均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，雷洛昔芬組，黃芪三仙湯高、中劑量組的骨小梁面積百分比均顯著增加（P＜0.05），黃芪三仙湯低劑量組的差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖2-D結果顯示：模型組大鼠的骨小梁分離度較正常組、假手術組均顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，雷洛昔芬組，黃芪三仙湯高、中劑量組的的骨小梁分離度均顯著降低（P＜0.05），黃芪三仙湯低劑量組的差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠股骨遠端組織形態學、形態計量學分析比較Figure 2 Comparison of distal femur bone morphology and morphometric analysis in various groups of rats

整個骨組織形態計量學結果表明，黃芪三仙湯各治療組對去卵巢骨質疏松大鼠骨小梁微結構具有改善作用，且呈劑量依賴性。

2.3 黃芪三仙湯對PMOP大鼠股骨組織p-Akt1/Akt1、p-Akt2/Akt2、ERα表達的影響圖3、圖4結果顯示：模型組大鼠股骨組織p-Akt1/Akt1、p-Akt2/Akt2和ERα的蛋白相對表達量顯著低于假手術組和正常組（P＜0.05）。與模型組比較，雷洛昔芬組，黃芪三仙湯高、中劑量組股骨組織p-Akt1/Akt1、p-Akt2/Akt2和ERα蛋白相對表達量顯著增加（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠股骨組織p-Akt1/Akt1、p-Akt2/Akt2表達比較Figure 3 Comparison of expression of p-Akt1/AKT1 and p-Akt2/Akt2 in femur tissue in various groups of rats

圖4 各組大鼠股骨組織ERα蛋白表達比較Figure 4 Comparison of protein expression of ERα in femur tissue in various groups of rats

2.4 黃芪三仙湯對PMOP成骨細胞增殖的影響圖5結果顯示：與2.5%濃度的雷洛昔芬血清組和黃芪三仙湯血清組比較，含有5%、10%、15%和20%濃度的對應藥物血清組PMOP成骨細胞增殖能力均增強（P＜0.01），且20%濃度的藥物血清組PMOP成骨細胞增殖能力更明顯（P＜0.001）。

圖5 黃芪三仙湯對PMOP成骨細胞增殖的影響Figure 5 Effect of Huangqi Sanxian Decoction on proliferation of PMOP osteoblasts

以20%濃度的含藥血清處理24 h后，與正常血清組比較，雷洛昔芬血清組PMOP成骨細胞增殖能力增強（P＜0.01），黃芪三仙湯血清組則不明顯（P＞0.05）；培養48、72 h后，與正常血清組比較，雷洛昔芬血清組和黃芪三仙湯血清組PMOP成骨細胞增殖能力均明顯增強（P＜0.01），且72 h作用效果優于48 h（P＜0.001）。

2.5 黃芪三仙湯對PMOP成骨細胞分化和礦化的影響圖6、圖7結果顯示：與正常血清組比較，雷洛昔芬血清組和黃芪三仙湯血清組堿性磷酸酶活性明顯增強（P＜0.01）。當細胞培養3 d后，PMOP成骨細胞產生礦化結節。與正常血清組比較，雷洛昔芬血清組和黃芪三仙湯血清組PMOP成骨細胞礦化結節顯著增加（P＜0.001）。

圖6 黃芪三仙湯對PMOP成骨細胞分化的影響Figure 6 Effect of Huangqi Sanxian Decoction on differentiation of PMOP osteoblasts

圖7 黃芪三仙湯對PMOP成骨細胞礦化的影響Figure 7 Effect of Huangqi Sanxian Decoction on mineralization of PMOP osteoblasts

2.6 黃芪三仙湯對PMOP成骨細胞PI3K/Akt通路蛋白活化和ERα表達的影響圖8、圖9結果顯示：與正常血清組比較，雷洛昔芬血清組和黃芪三仙湯血清組PMOP成骨細胞中p-Akt1/Akt1、p-Akt2/Akt2和ERα蛋白相對表達量顯著升高（P＜0.05）。添加PI3K/Akt通路抑制劑LY294002后，黃芪三仙湯血清+LY294002組中p-Akt1/Akt1、p-Akt2/Akt2和ERα蛋白相對表達量較黃芪三仙湯血清組降低（P＜0.05）。

圖8 各組PMOP成骨細胞p-Akt1/Akt1、p-Akt2/Akt2蛋白表達比較Figure 8 Comparison of relative expression of p-Akt1/Akt1 and p-Akt2/Akt2 in of various groups PMOP osteoblasts

圖9 各組PMOP成骨細胞ERα蛋白表達比較Figure 9 Comparison of ERα protein expression in various groups of PMOP osteoblasts

2.7 黃芪三仙湯通過PI3K/Akt通路對PMOP成骨細胞分化的影響圖10結果顯示：雷洛昔芬血清組和黃芪三仙湯血清組的堿性磷酸酶活性較正常血清組升高（P＜0.01）。LY294002干預后，與黃芪三仙湯血清組比較，黃芪三仙湯血清+LY294002組的堿性磷酸酶活性顯著降低（P＜0.001）。

圖10 各組PMOP成骨細胞堿性磷酸酶活性比較Figure 10 Comparison of ALP activity in various groups of PMOP osteoblasts

圖11結果顯示：黃芪三仙湯血清組和雷洛昔芬血清組的成骨分化相關因子Runx2、Osx和OPN蛋白相對表達量明顯高于正常血清組（P＜0.05）。LY294002干預后，與黃芪三仙湯血清組比較，黃芪三仙湯血清+LY294002組的Runx2、Osx和OPN蛋白相對表達量仍顯著降低（P＜0.05）。

圖11 各組PMOP成骨細胞Runx2、Osx和OPN蛋白表達比較Figure 11 Comparison of protein expression of Runx2，Osx and OPN in various groups of PMOP osteoblasts

3 討論

絕經后骨質疏松癥（PMOP）可歸屬于中醫學“骨痿”的范疇。歷代醫家對PMOP的中醫辨證，多以腎虛、血瘀為主。腎藏精，精生骨髓，髓養骨，正如《素問·陰陽應象大論》所云：“腎生骨髓，在體為骨。”故腎虛是PMOP最主要的病機[13]。而絕經后女性體質特點除“虛”外，另一特征為“瘀”。《醫林改錯》言：“元氣既虛，必不能達于血管，血管無氣，必停留而瘀。”故血瘀也是骨痿的關鍵病機。因此，“補腎活血”被認為是PMOP的主要中醫治法。黃芪三仙湯正是經典的補腎活血復方，由淫羊藿、肉蓯蓉、威靈仙等溫陽補腎中藥和黃芪、當歸、丹參、三七、延胡索等活血養血中藥共同組成。

血清藥理學是指在經過一段時間給動物灌服中藥或中藥復方后，收集血液，分離出血清，采用提取的含藥血清替代中藥或中藥復方進行體外藥理實驗的一種半體內實驗方法[14]。由于中藥及中藥復方成分多樣復雜，需經體內吸收、代謝等過程，最終入血的成分才是中藥有效成分[15]。

本研究從PMOP大鼠模型股骨中提取原代PMOP成骨細胞，用含黃芪三仙湯的血清進行干預，觀察其對PMOP成骨細胞的增殖、分化和礦化的影響。CCK-8法檢測結果顯示，含有黃芪三仙湯的血清促進了PMOP成骨細胞的增殖，干預時間越長，效果越明顯。在PMOP成骨細胞分化和礦化過程中，高表達的ALP和細胞內的礦化結節是成骨細胞的表型標志物[16]。本研究結果顯示，黃芪三仙湯血清組的ALP活性、經茜素紅染色的礦化結節數量都較正常血清組顯著增高，表明黃芪三仙湯可促進PMOP成骨細胞分化、礦化能力。故認為，黃芪三仙湯可通過促進PMOP成骨細胞的增殖、分化和礦化，從而促進骨形成和減少骨質流失。

ERα被認為是雌激素骨骼保護作用的主要調節因子。有研究發現，在激素水平正常的情況下，雌激素可通過ERα發揮級聯反應，參與維持骨代謝平衡[17]。本研究成功構建PMOP大鼠模型后，觀察成骨細胞中ERα的表達情況，體內外研究結果顯示，黃芪三仙湯可顯著提高PMOP大鼠股骨組織ERα的表達，且體外研究結果顯示，與黃芪三仙湯血清組比較，加入PI3K/Akt抑制劑LY294002后，PMOP成骨細胞ERα蛋白相對表達量顯著降低。既往有研究表明，通過ERα調控PI3K/Akt信號傳導可防止去卵巢引起的骨質疏松[6]。ERα與PI3K的 調 節 亞 基p85結 合 可 激 活PI3K/Akt，活化的Akt能夠磷酸化ERα中ser167，這提示PI3K/Akt信號通路與ERα之間有雙向調節作用[18-19]。p-Akt1/Akt1、p-Akt2/Akt2是PI3K/Akt通路的核心蛋白。本研究結果顯示，黃芪三仙湯血清組PMOP成骨細胞p-Akt1/Akt1、p-Akt2/Akt2活化水平較正常血清組明顯升高，加入PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002后，p-Akt1/Akt1、p-Akt2/Akt2升高現象被抑制，這表明黃芪三仙湯可通過促進PMOP成骨細胞中ERα的表達進一步激活PI3K/Akt信號通路，發揮促成骨作用。

Runx2、Osx、OPN是調節成骨分化及骨發育的關鍵因子[20-23]。體外研究結果顯示，黃芪三仙湯血清組PMOP成骨細胞Runx2、Osx、OPN蛋白表達增強，加入PI3K/Akt通路抑制劑LY294002后，翻轉了黃芪三仙湯血清對PMOP成骨細胞Runx2、Osx、OPN的促進作用，表明黃芪三仙湯可通過激活PI3K/Akt信號通路增強成骨分化相關標志物Runx2、Osx和OPN的蛋白表達，促進PMOP成骨細胞的分化，加速骨形成。

綜上所述，黃芪三仙湯可提高PMOP大鼠的骨密度，改善骨小梁結構，并可促進成骨細胞的增殖、分化、礦化，其機制可能是通過PI3K/Akt信號通路促進骨細胞ERα及成骨分化關鍵因子Runx2、Osx和OPN的表達，促進骨形成。