馬鞭草總苷對大鼠慢性前列腺炎/骨盆疼痛綜合征的改善作用及機制研究

李長建，焦玉濤，王玉華，吳春磊

（1.新鄉醫學院第三附屬醫院泌尿外科，河南新鄉 453003；2.新鄉醫學院第一附屬醫院泌尿外科，河南新鄉 453100）

慢性前列腺炎/骨盆疼痛綜合征（chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome，CP/CPPS）是成年男性常見的泌尿系統疾病，占慢性前列腺炎的90%以上，本病表現為不同程度的下尿路癥狀和性功能障礙，并伴有頑固持續性的盆腔會陰區域疼痛，嚴重影響患者的生活[1-2]。馬鞭草（Verbena officinalisL.）為中醫臨床治療前列腺炎的常用中草藥，具有補腎益肝、利水消腫、潤腸通便之功效[3]。馬鞭草主要活性成分——馬鞭草總苷對消痔靈誘導的慢性非細菌性前列腺炎（chronic nonbacterial protatitis，CNP）小鼠和大鼠模型均有較好的改善作用[4-5]，因此，馬鞭草總苷對CP/CPRS是否具有抗炎、鎮痛作用值得進一步深入研究。p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信號通路與動物體內的應激反應和免疫調控密切相關，可通過調節炎性因子的活性廣泛參與慢性前列腺炎疼痛的發生與發展[6]。本研究建立CP/CPPS大鼠模型，觀察p38MAPK信號通路及輔助性T細胞（Th）1/Th2細胞平衡的變化，并進一步探討馬鞭草總苷對CP/CPPS的抗炎、鎮痛作用及具體機制，以期為臨床上CP/CPPS的治療提供新的方法和依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級雄性SD大鼠45只，8周齡，體質量200~220 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物質量合格證號：201912108，動物生產許可證號：SCXK（京）2019-1-005。實驗大鼠飼養及組織取材均于新鄉醫學院實驗動物中心完成。飼養環境：室溫（23±2）℃，12 h循環明暗燈光，恒定濕度。飼養期間給予嚙齒類動物標準顆粒飼料，自由飲水。

1.2 藥品與試劑馬鞭草總苷（總環烯醚萜苷含量為51.26%，批號：20190327），購自江蘇南京青澤醫藥科技有限公司；吸附無細胞百白破聯合疫苗（批號：20190408-3）購自武漢生物制品研究所；完全弗式佐劑，大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素8（IL-8）酶聯免疫吸咐分析（ELISA）試劑盒購自美國Sigma公司；兔抗大鼠p38MAPK、p-p38MAPK多克隆抗體及基質金屬蛋白酶9（MMP-9）單克隆抗體購自美國Abcam公司。

1.3 儀器IX73倒置熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯光學有限公司；BD FACS Calibur流式細胞儀購自Beckman公司；Von Frey纖維絲測痛儀購自意大利Ugo Basile Srl公司；冷凍干燥機購自松源華興有限公司；Chemi Doc XRS+System凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司；Multiskan Sky 450 nm酶標儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.4 CP/CPPS大鼠模型的建立參考文獻研究[7]的方法制備前列腺蛋白提純液：處死5只雄性SD大鼠，剝離全部前列腺組織，加入等質量的生理鹽水溶液制備成組織勻漿，低溫離心（15 000 r/min，離心半徑15 cm）30 min，收集上清，用冷凍干燥，機制備成凍干粉末（-80℃保存），臨用前與適量生理鹽水混合，制成1.0 mg/mL的前列腺蛋白提純液。參考文獻研究[8]的方法制備CP/CPPS大鼠模型：大鼠適應性喂養1周后，在實驗的第0、7、14、28天，用10 g/L戊巴比妥鈉腹腔麻醉，于大鼠盆腔區域皮下及雙側肩胛皮下多點（≥6）注射前列腺蛋白提純液和完全弗氏佐劑（1∶1 200 μL），同時，腹腔注射0.5 mL百白破疫苗[8]。

1.5 動物分組與給藥方法將造模成功的32只CP/CPPS模型大鼠按照隨機數字表分為模型對照組，馬鞭草總苷低、中、高劑量組，每組8只，另設8只正常大鼠作為空白對照組。在建模第30天開始進行馬鞭草總苷的干預，連續22 d，每日1次。馬鞭草總苷低、中、高劑量組分別對應灌胃30、60、120 mg·kg-1的馬鞭草總苷[4]，空白對照組和模型對照組則灌胃等體積的生理鹽水。末次給藥后的第2天，進行后續相關指標檢測。

1.6 觀察指標與方法

1.6.1 機械性異常痛敏測定末次給藥后的第2天，參考文獻研究[9]的方法，用Von Frey纖維絲測痛儀測定各組大鼠機械性痛閾。安靜環境下，將大鼠放置在疼痛檢測鋼絲籠內，在適應10 min后，用Von Frey纖維絲垂直刺激其骨盆區域10次，每次進行10 s，2次刺激間隔20 s，刺激程度由輕及重（0.008~4 g），待大鼠表現出立即舔或抓蹭刺激區域、腹部急劇收縮或跳躍等陽性反應時，記錄測痛儀的壓力值，即為痛反應閾值（g）。

1.6.2 前列腺指數測定末次給藥后第2天，各組大鼠禁食后稱定體質量，處死大鼠，剝離前列腺組織并準確稱質量，計算前列腺指數（前列腺指數=前列腺濕質量/體質量×100%）。

1.6.3 前列腺組織病理檢查將上述獲取的前列腺組織參考文獻研究[10]的方法制備病理學切片。用體積分數4%甲醛溶液固定24 h，二甲苯透明，石蠟包埋，蘇木素-伊紅染色后，在顯微鏡下觀察前列腺標本的組織病理學改變，分析各組大鼠前列腺的腺體結構、導管以及腺體周圍間質的差異。

1.6.4 流式細胞術檢測外周血Th1、Th2淋巴細胞百分比參考文獻研究[11]的方法將獲得的外周血進行細胞培養、活化及細胞表面抗原標記、破膜及胞內細胞因子染色。方法：100 μL外周血加入100 μL RPMI 1640培養液、刺激劑佛醇乙酯（PMA）（25 ng/mL）和離子霉素（Ion-omycin）（1 μg/mL），隨后加入蛋白轉運阻斷劑藍菌素A（BFA）（10 μg/mL），混勻后在體積分數5%CO2培養箱中37℃培養4 h，各加入CD3-PC5和CD8-FITC進行標記。加入Fix&Perm破膜劑分別固定、破膜和溶血。加入抗大鼠IFN-γ PE、IL-4 PE進行胞內細胞因子染色，隨后上機檢測。使用CD3+CD8-設門來圈定CD4+T細胞群，在收集1×104個細胞后，使用Cellquest軟件分析得出Th1（CD3+CD8-/IFNγ+）和Th2（CD3+CD8-/IL-4+）的百分比及相應細胞分布。

1.6.5 ELISA法檢測前列腺組織TNF-α、IL-1β及IL-8含量將上述獲取的前列腺組織參考文獻研究[12]的方法制備前列腺組織勻漿，4℃離心（3 000 r/min，離心半徑15 cm）15 min，分離上清，嚴格按照TNF-α、IL-1β、IL-8試劑盒說明書步驟操作，最后應用全自動酶標儀在450 nm波長處檢測光密度值，計算各指標含量。

1.6.6 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測前列腺組織總p38MAPK、p-p38MAPK及MMP-9的表達取前列腺組織，參考文獻研究[13]的方法制備前列腺組織勻漿，提取總蛋白，用二喹啉甲酸（BCA）試劑盒進行蛋白定量。繼而常規上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，封閉，兔抗鼠MMP-9單克隆一抗（1∶100稀釋）、p38MAPK（1∶100稀釋）多克隆一抗和p-p38MAPK（1∶100稀釋）多克隆一抗孵育及辣根過氧化物酶標志鼠抗兔二抗（1∶2 000稀釋）孵育，化學底物發光法顯色，圖像掃描分析，最后應用Image-QuaNT軟件測量其光密度，以各β-actin為內參對照分析。

1.7 統計方法采用SPSS 21.0統計方法進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠前列腺組織病理變化比較圖1結果顯示：空白對照組大鼠前列腺組織結構完整清晰，未見水腫、充血，腺腔和間質內未見炎癥細胞浸潤，腺泡間纖維分布正常；模型對照組大鼠前列腺組織出現了嚴重的結構紊亂，可見明顯的水腫和充血，腺腔內分泌物明顯減少，腺腔和間質內有大量的炎癥細胞浸潤，腺腔壁上皮細胞明顯增生；馬鞭草總苷低劑量組大鼠前列腺組織可見輕微損傷破壞，可見水腫和充血，腺腔和間質內有中等量的纖維增生及炎癥細胞浸潤；馬鞭草總苷中劑量組大鼠前列腺組織未見明顯損傷破壞，未見水腫和充血，但腺腔和間質內有少量的纖維增生及炎癥細胞浸潤；馬鞭草總苷高劑量組大鼠前列腺組織同樣未見明顯的損傷破壞、水腫和充血，整個前列腺基底膜較為完整，腺腔和間質未有纖維增生，但可見較少量的炎癥細胞浸潤。

圖1 各組大鼠前列腺組織病理變化比較（HE染色法，×200）Figure 1 Comparison of histopathological changes of prostate tissues in various groups of rats（by HE staining，×200）

2.2 各組大鼠前列腺指數、機械痛閾值比較表1結果顯示：前列腺指數與機械痛閾值各組間比較，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。與空白對照組比較，模型對照組大鼠前列腺指數顯著增加（P＜0.05），機械痛閾值顯著降低（P＜0.01）；與模型對照組比較，馬鞭草總苷低、中、高劑量組的前列腺指數顯著降低（P＜0.05）、機械痛閾值均顯著增加（P＜0.05或P＜0.01），且呈劑量依賴性。

表1 各組大鼠前列腺指數、機械痛閾值比較Table 1 Comparison of prostate index and mechanical pain threshold in various groups of rats（±s）

表1 各組大鼠前列腺指數、機械痛閾值比較Table 1 Comparison of prostate index and mechanical pain threshold in various groups of rats（±s）

①P＜0.05，②P＜0.01，與空白對照組比較；③P＜0.05，④P＜0.01，與模型對照組比較

前列腺指數/（mg?g-1）2.05±0.18 3.57±0.26①3.14±0.31①③2.52±0.24①③2.27±0.21③4.569 0.023機械痛閾值/g 71.22±6.75 41.57±3.98②47.59±4.41②③54.66±4.69②③66.78±5.38①④6.583 0.008組別空白對照組模型對照組馬鞭草總苷低劑量組馬鞭草總苷中劑量組馬鞭草總苷高劑量組F值P值鼠數/只8 8 8 8 8

2.3 各組大鼠前列腺組織TNF-α、IL-1β及IL-8含量比較表2結果顯示：TNF-α、IL-1β及IL-8含量各組間比較，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。與空白對照組比較，模型對照組的TNF-α、IL-1β及IL-8含量均顯著增加（P＜0.01）；與模型對照組比較，馬鞭草總苷低、中、高劑量組的TNF-α、IL-1β及IL-8含量均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），且呈劑量依賴性。

表2 各組大鼠前列腺組織TNF-α、IL-1β及IL-8含量比較Table 2 Comparison of contents of TNF-α，IL-1β and IL-8 in the prostate tissues in various groups of rats （±s，ng·g-1 prot）

表2 各組大鼠前列腺組織TNF-α、IL-1β及IL-8含量比較Table 2 Comparison of contents of TNF-α，IL-1β and IL-8 in the prostate tissues in various groups of rats （±s，ng·g-1 prot）

①P＜0.05，②P＜0.01，與空白對照組比較；③P＜0.05，④P＜0.01，與模型對照組比較

組別空白對照組模型對照組馬鞭草總苷低劑量組馬鞭草總苷中劑量組馬鞭草總苷高劑量組F值P值IL-8 7.25±0.68 18.65±1.57②15.43±1.09①③11.74±0.84①③8.41±0.73③13.457 0.003鼠數/只8 8 8 8 8 TNF-α 17.32±3.52 35.42±3.73②30.42±3.36②③23.28±2.91①③19.47±2.21④6.283 0.009 IL-1β 23.46±2.68 47.35±3.75②40.68±3.09②③33.81±2.69②③26.59±1.98①④18.662<0.001

2.4 各組大鼠前列腺組織p38MAPK信號通路相關蛋白表達的比較圖2、表3結果顯示：p38MAPK蛋白相對表達量各組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05），但p-p38MAPK、MMP-9蛋白相對表達量及p-p38MAPK/p38MAPK比值組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。與空白對照組比較，模型對照組的p-p38MAPK、MMP-9蛋白相對表達量及p-p38MAPK/p38MAPK比值均顯著增加（P＜0.05）；與模型對照組比較，馬鞭草總苷低、中、高劑量組的p-p38MAPK、MMP-9蛋白相對表達量及p-p38MAPK/p38MAPK比值均顯著降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

表3 各組大鼠前列腺組織p38MAPK信號通路相關蛋白表達的比較Table 3 Comparison of expression of p38MAPK signaling pathway-related proteins in prostate tissues of various groups of rats （x±s）

圖2 各組大鼠前列腺組織p38MAPK信號通路相關蛋白Western Blot電泳條帶Figure 2 Western Blot electrophoretic bands of p38MAPK signaling pathway-related proteins in prostate tissues in various groups of rats

2.5 各組大鼠外周血Th1、Th2淋巴細胞百分比及Th1/Th2比值的比較表4結果顯示：Th1淋巴細胞百分比及Th1/Th2比值各組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。與空白對照組比較，模型對照組大鼠Th1淋巴細胞百分比及Th1/Th2比值顯著升高（P＜0.05），Th2淋巴細胞百分比顯著降低（P＜0.05）；與模型對照組比較，馬鞭草總苷低、中、高劑量組的Th1淋巴細胞百分比及Th1/Th2比值顯著降低（P＜0.05），Th2淋巴細胞百分比顯著升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

表4 各組大鼠外周血Th1、Th2淋巴細胞百分比及Th1/Th2比值的比較Table 4 Comparison of Th1，Th2 lymphocyte percentage and Th1/Th2 ratio in peripheral blood in various groups of rats （x±s）

3 討論

慢性前列腺炎/骨盆疼痛綜合征（CP/CPPS）是慢性前列腺炎的常見類型，臨床主要以改善排尿不暢、緩解疼痛、提高患者生活質量為主[14]。馬鞭草總苷為馬鞭草中的主要活性成分。在本研究中，馬鞭草總苷對CP/CPPS模型大鼠干預后，可顯著保護前列腺組織，減少前列腺的纖維增生及炎癥細胞浸潤，同時可明顯降低模型大鼠的前列腺指數，不同程度地改善前列腺增大的癥狀。這表明馬鞭草總苷對CP/CPPS具有較好的改善作用。陰部或前列腺區域酸脹痛甚至劇痛是困擾CP/CPPS綜合征患者的主要問題，在臨床一直備受重視[15]。在本研究中，馬鞭草總苷的干預可明顯提高CP/CPPS模型大鼠的機械痛閾值，表明馬鞭草總苷能夠有效緩解CP/CPPS的疼痛癥狀。預測臨床應用馬鞭草可能可以有效克服CP/CPPS患者伴隨的持續性、難治性的疼痛問題，故對此作用及機制我們做了進一步的探討。

有研究表明，在Ⅲ型前列腺炎患者的前列腺液中均發現了IL-1β、TNF-α等炎癥因子的升高，認為該炎性細胞因子參與了CP/CPPS的病理進展，其表達水平與CP/CPPS患者的病理性疼痛等問題密切相關[16]。在本研究中，馬鞭草總苷的干預能夠明顯減少CP/CPPS模型大鼠前列腺組織中TNF-α、IL-1β及IL-8炎性因子的含量，并且隨著劑量的增加，降低作用更明顯，這與上述馬鞭草總苷改善CP/CPPS模型大鼠前列腺病理進程及疼痛閾值結果相一致。p38 MAPK信號通路廣泛參與了動物體內的應激反應和炎癥反應，有研究表明，炎癥因子TNF-α作為p38 MAPK信號通路的上游啟動因子可激活p38 MAPK信號通路，使其磷酸化水平提高，繼而又加劇炎性因子和MMP-9的表達，造成前列腺炎組織進一步損害[17-18]。在本研究中，馬鞭草總苷干預后，CP/CPPS模型大鼠前列腺組織MMP-9蛋白相對表達量及p-p38MAPK/p38MAPK比值均顯著降低，表明馬鞭草總苷抑制了p38MAPK蛋白的磷酸化，其可通過調控p38MAPK信號通路降低炎癥因子的表達，進而改善CP/CPPS的炎癥反應和疼痛。

自身免疫和T細胞增殖反應參與了CP/CPPS的病理進程，T細胞亞群（Th1/Th2）之間的相互協調對于維持男性泌尿生殖系統的正常免疫平衡尤為重要，Th1細胞分泌的IFNγ可抑制Th2類細胞因子的產生，而Th2細胞分泌的IL-4則能夠下調Th1細胞的功能[15，19]。在本研究中，馬鞭草總苷干預后，CP/CPPS模型大鼠外周血Th1淋巴細胞百分比及Th1/Th2比值顯著降低，表明馬鞭草總苷能夠調節T細胞亞群比例，對CP/CPPS過程中的Th1/Th2漂移起到恢復作用。

綜上所述，馬鞭草總苷能有效降低CP/CPPS模型大鼠的前列腺指數。抑制炎癥反應，其作用機制可能與下調p38MAPK信號通路相關調控蛋白和調節Th1/Th2細胞亞群比例有關。本研究初步探究了馬鞭草總苷治療CP/CPPS的抗炎、鎮痛作用，顯示馬鞭草總苷臨床治療CP/CPPS有一定的應用前景。