黃芪注射液對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響及其機制研究

柯雙橋，張婷，龐瑞明

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬寶安中醫(yī)院，廣東深圳 518000；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100000）

充血性心力衰竭（congestive heart failure，CHF）是指由于各種原因引起的心肌結(jié)構(gòu)和功能的改變并導(dǎo)致心室泵血和（或）充盈功能低下的臨床綜合征[1]。其發(fā)病機制和臨床防治的研究仍是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)面臨的重大課題[2]。其臨床以胸痛、心悸、神疲、乏力等為主要表現(xiàn)，根據(jù)患者的不同癥狀表現(xiàn)，中醫(yī)學(xué)將心力衰竭歸屬于“喘證”“水腫”“心悸”等范疇。多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為CHF的病因病機為本虛標(biāo)實，即氣虛陽虛為本，血瘀水泛為標(biāo)[3]。心氣虛是CHF的病機基礎(chǔ)，是其發(fā)生的始動環(huán)節(jié)。心氣虛則無力溫運血脈，血行不暢，停而為瘀，終致心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展甚或惡化。黃芪是臨床常用的益氣中藥，味甘，性微溫，可補氣升陽、固表止汗、利水消腫，其性味功效與心力衰竭之病機相契合，在以益氣法治療心力衰竭的過程中發(fā)揮著重要作用。臨床試驗研究[4]中，對慢性心力衰竭患者應(yīng)用黃芪注射液不僅能夠改善心室舒張與收縮情況，還能夠?qū)⒏黜椥氖抑貥?gòu)指標(biāo)降低，從而糾正異常血流，控制病情進展。但黃芪注射液的治療機制尚不清楚，在一定程度上限制了其臨床應(yīng)用。有研究表明，心肌細(xì)胞是一種終末分化細(xì)胞，若心肌細(xì)胞不斷死亡丟失，則意味著心臟泵血功能的下降，導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展，是從代償走向失代償?shù)霓D(zhuǎn)折點[4]。本研究構(gòu)建心肌細(xì)胞凋亡模型，探討黃芪注射液對H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響及機制。現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞大鼠H9c2心肌細(xì)胞系，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所國家實驗細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺。

1.2 藥物與試劑黃芪注射液組，購自神威藥業(yè)集團有限公司，批號：國藥準(zhǔn)字Z13020999。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清以及胰蛋白酶，購自美國Gibco公司；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶Ⅱ（AngⅡ）（批號：ANGT-003），購自中國杭州中肽生化有限公司；TRIzol購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、擴增試劑盒，購自北京天根生化科技有限公司；引物由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成提供；電壓依賴性陰離子通道蛋白1（VDAC1）、線粒體融合蛋白2（Mfn2）、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白75（GRP75）等抗體購自美國Abcam公司；Mfn2購自美國Proteintech公司；全蛋白提取試劑盒與二喹啉甲酸（BCA）蛋白含量檢測試劑盒購自江蘇凱基技術(shù)生物有限公司；鈣離子熒光探針Fura-2AM試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；ATP比色/熒光測定試劑盒，購自美國Sigma-Aldrich公司；異硫氰酸熒光素-膜聯(lián)蛋白V（FITC-Annexin V）/碘化丙啶（PI）凋亡檢測試劑盒，購自美國BD公司；其他試劑為市售分析純試劑。

1.3 儀器Gene Quant紫外分光光度計（Pharmacia Biotech公司）；基因擴增儀GeneAmp PCR Sys-tem 9700（美國ABI公司）；實時熒光定量PCR儀Mx3000P（美國安捷倫科技公司）；RT-6000酶標(biāo)儀（深圳Rayto公司）；WesTM全自動蛋白表達分析系統(tǒng)（普諾森生物科技有限公司）。

1.4 細(xì)胞分組與處理大鼠H9c2心肌細(xì)胞系以含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基于37℃的CO2孵育箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長至80%～90%時去上清，加入無血清DMEM。將細(xì)胞分為3組，處理如下：對照組，常規(guī)培養(yǎng)，AngⅡ濃度為0 mol/L；模型組，以AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡為模型，AngⅡ濃度為1×10-7mol/L；AngⅡ+黃芪注射液組，給藥濃度為AngⅡ1×10-7mol/L+0.125%黃芪注射液。各處理組細(xì)胞孵育48 h后進行檢測。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 CCK-8法檢測細(xì)胞活性按實驗方案處理心肌細(xì)胞后，于96孔板每孔100 μL培養(yǎng)基中加入10 μL CCK-8母液，繼續(xù)孵育4 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀于450 nm波長處測定其光吸收度（OD）值。實驗結(jié)果以細(xì)胞存活率表示，細(xì)胞存活率=（實驗組OD值-空白對照組OD值）/（對照組OD值-空白對照組OD值）×100%。

1.5.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況具體操作步驟按照FITC-Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒說明書進行。細(xì)胞在25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)處理后，4℃PBS洗2次。用Binding buffer重懸細(xì)胞，細(xì)胞濃度為1×106個/mL，取100 μL。加5 μL FITC-Annexin V和PI混勻后室溫避光孵育15 min，加400 μL Binding buffer，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.5.3 ATP比色/熒光法檢測細(xì)胞中ATP含量的變化具體操作步驟按照ATP比色/熒光測定試劑盒說明書進行。

1.5.4 鈣離子熒光探針Fura-2AM檢測H9c2細(xì)胞鈣離子含量H9c2在96孔板培養(yǎng)處理后，D-Hanks清洗3次，加入2.5 μmol/L Fura-2于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，D-Hanks洗3次，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 min后，應(yīng)用酶標(biāo)儀測量340、380 nm激發(fā)光下的510 nm發(fā)射光吸光度，計算兩者比值，即為細(xì)胞鈣含量。

1.5.5 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測細(xì)胞VDAC1、Mfn2、GRP75 mRNA表達細(xì)胞去上清，PBS洗3次，吸干所有液體，加入TRIzol裂解細(xì)胞提取總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計測定RNA濃度和純度。取2 μg總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。配制20 μL PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95℃10 min預(yù)變性，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸20 s，40次循環(huán)。目的基因引物序列：VDAC1上游引物序列為5’-CTCTGGTGCTTGGCTATG-3’，下游引物序列為5’-CCTGATACTTGGCTGCT ATT-3’，擴增片段103 bp；Mfn2上游引物序列為5’-TAAGCAGATGACAGAGGAAG-3’，下游引物序列為5’-GCACAGACACAGGAAGAA-3’，擴增片段119 bp；GRP75上游引物序列為5’-GCGTCA GAAGCAATCAAG-3’，下游引物序列為5’-TCAT CATATCGTCGTCCAAT-3’，擴 增 片 段135 bp；GAPDH上游引物序列為5’-AGTTCAACGGCACAG TCAAG-3’，下游引物序列為5’-TACTCAGCACC AGCATCACC-3’，擴增片段106 bp。

1.5.6 蛋白免疫印跡（Western Blot）檢測細(xì)胞VDAC1、Mfn2、GRP75蛋白表達收集細(xì)胞于1.5 mL EP管中，每管細(xì)胞（1×106個）加入100 μL裂解液中，用超聲破碎儀裂解，收集上清，BCA法測定蛋白定量。配制十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠并進行電泳（參考分子克隆實驗指南），將蛋白電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，浸沒于封閉液中緩慢搖蕩1 h。用封閉液稀釋一抗至工作濃度（GAPDH為1∶5 000，VDAC1為1∶1 000，Mfn2為1∶1 000，GRP75為1∶1 000），將膜均勻浸入一抗中4℃過夜。TBST洗膜，將膜置于封閉液中室溫孵育1 h，加入二抗（1∶5 000稀釋）室溫孵育1 h，滴加發(fā)光液孵育2 min后化學(xué)發(fā)光成像。應(yīng)用ImageJ軟件進行圖像分析。結(jié)果以目的蛋白灰度值與內(nèi)參（GAPDH）灰度值比值表示。

1.6 統(tǒng)計方法采用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的AngⅡ、黃芪注射液對H9c2細(xì)胞活性的影響AngⅡ濃度小于1×10-7mol/L時，對細(xì)胞增殖沒有顯著影響；黃芪注射液濃度為0.125%時，對H9c2細(xì)胞的促增殖作用最為顯著。具體結(jié)果見圖1。故選擇AngⅡ濃度1×10-7mol/L、0.125%黃芪注射液進行后續(xù)實驗。

圖1 不同濃度AngⅡ、黃芪注射液對H9c2心肌細(xì)胞活性的影響（CCK-8法）Figure 1 Effects of different concentrations of AngⅡand Astragalus injection on H9c2 myocardial cell activity（by CCK-8 method）

2.2 黃芪注射液對AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響與對照組比較，AngⅡ組細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.01）；與AngⅡ組比較，AngⅡ組+黃芪注射液組細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.01）。具體結(jié)果見圖2。表明AngⅡ可誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞發(fā)生顯著凋亡，黃芪注射液可抑制其凋亡的發(fā)生。

圖2 黃芪注射液對AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響Figure 2 Effects of Astragalus injection on apoptosis of H9c2 myocardial cells induced by AngⅡ

2.3 黃芪注射液對AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞ATP含量的影響與對照組比較，AngⅡ組ATP含量升高（P＜0.01）；與AngⅡ組比較，AngⅡ+黃芪注射液組ATP含量降低（P＜0.05）。具體結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，H9c2經(jīng)過AngⅡ刺激48 h后ATP含量增加，黃芪注射液可以抑制由AngⅡ引起的ATP增加。

圖3 黃芪注射液對AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞ATP含量的影響Figure 3 Effect of Astragalus injection on ATP content of H9c2 myocardial cells induced by AngⅡ

2.4 黃芪注射液對AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞鈣含量的影響與對照組比較，AngⅡ組鈣含量升高（P＜0.05）；與AngⅡ組比較，AngⅡ+黃芪注射液組鈣含量降低（P＜0.01）。具體結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，AngⅡ誘導(dǎo)48 h后可以導(dǎo)致細(xì)胞胞漿鈣含量顯著增加，黃芪注射液處理可以顯著下調(diào)鈣含量的增加，提示黃芪注射液可以調(diào)節(jié)并維持心肌細(xì)胞胞漿的正常鈣含量。

圖4 黃芪注射液對AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞鈣含量的影響Figure 4 Effect of Astragalus injection on calcium content of H9c2 myocardial cells induced by AngⅡ

2.5 黃芪注射液對AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞VDAC1、Mfn2、GRP75 mRNA表達的影響與對照組比較，AngⅡ組Mfn2、GRP75 mRNA表達水平升高（P＜0.05），VDAC1 mRNA表達水平降低（P＜0.05）；與AngⅡ組比較，AngⅡ+黃芪注射液組Mfn2、GRP75 mRNA表達水平降低（P＜0.05），VDAC1 mRNA表達水平升高（P＜0.05或P＜0.01）。具體結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，AngⅡ誘導(dǎo)可以抑制H9c2心肌細(xì)胞VDAC1 mRNA表達，而黃芪注射液可以恢復(fù)其表達抑制；AngⅡ誘導(dǎo)可以促進H9c2心肌細(xì)胞Mfn2、GRP75 mRNA表達，黃芪注射液可以抑制其表達的增高。

圖5 黃芪注射液對AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞VDAC1、Mfn2、GRP75 mRNA表達的影響（RT-PCR法）Figure 5 Effects of Astragalus injection on mRNA expression of VDAC1，Mfn2 and GRP75 in H9c2 myocardial cells induced by AngⅡ（by RT-PCR）

2.6 黃芪注射液對AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞VDAC1、Mfn2、GRP75蛋白表達的影響與對照組比較，AngⅡ組MAM結(jié)構(gòu)蛋白VDAC1、Mfn2、GRP75蛋白表達水平升高（P＜0.05或P＜0.01）；與AngⅡ組比較，AngⅡ+黃芪注射液組MAM結(jié)構(gòu)蛋白VDAC1、Mfn2、GRP75蛋白表達水平降低（P＜0.01）。具體結(jié)果見圖6。結(jié)果表明，AngⅡ孵育48 h可以導(dǎo)致H9c2心肌細(xì)胞MAM結(jié)構(gòu)蛋白VDAC1、Mfn2、GRP75蛋白表達增強，黃芪注射液可以顯著抑制其增強。

圖6 黃芪注射液對AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞VDAC1、Mfn2、GRP75蛋白表達的影響（Western blot法）Figure 6 Effects of Astragalus injection on protein expression of VDAC1，Mfn2，GRP75 in H9c2 myocardial cells induced by AngⅡ（by Western Blot method）

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，充血性心力衰竭（CHF）的發(fā)生發(fā)展與鈣信號傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、三磷酸腺苷（ATP）的生成及能量代謝等密切相關(guān)。越來越多的研究證實，心肌細(xì)胞凋亡可引起心臟可逆的收縮功能障礙，介導(dǎo)心力衰竭的起始、維持和進展，在心力衰竭中起著關(guān)鍵作用[5]。目前認(rèn)為，參與細(xì)胞凋亡的途徑有3條，即外源性死亡受體途徑、內(nèi)源性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑和內(nèi)源性線粒體途徑[6]，其中，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑的細(xì)胞凋亡成為心力衰竭相關(guān)研究的熱點，而線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)結(jié)構(gòu)和功能則是維持心肌細(xì)胞功能正常的關(guān)鍵。線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜（MAM）是線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生交互作用的功能區(qū)域，研究發(fā)現(xiàn)，有幾十種蛋白質(zhì)富集于此[7]，包括Mfn2、VDAC1、GRP75。已有研究表明，Mfn2及IP3R-VDAC-GRP75蛋白復(fù)合體是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)線粒體間鈣離子轉(zhuǎn)運的重要通道，調(diào)控鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到線粒體的轉(zhuǎn)運[8]，而鈣轉(zhuǎn)運是心肌細(xì)胞凋亡能量代謝的核心機制[9]，二者均可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，參與心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展。

AngⅡ是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的主要活性成分，有實驗研究表明，其在心肌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[10-11]，抑制由AngⅡ引起的細(xì)胞凋亡對于臨床防治心力衰竭意義重大。因此，本研究以AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡為模型。

本研究結(jié)果顯示：與對照組比較，AngⅡ組細(xì)胞凋亡率，ATP含量，鈣含量，Mfn2、GRP75 mRNA表達水平，VDAC1、Mfn2、GRP75蛋白表達水平升高，VDAC1 mRNA表達水平降低（P＜0.05或P＜0.01）；與AngⅡ組比較，AngⅡ+黃芪注射液組細(xì)胞凋亡率，ATP含量，鈣含量，Mfn2、GRP75 mRNA表達水平，VDAC1、Mfn2、GRP75蛋白表達水平降低，VDAC1 mRNA表達水平升高（P＜0.05或P＜0.01）。表明黃芪注射液可以有效減弱AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞能量代謝，抑制鈣超載，調(diào)控DAC1、Mfn2、GRP75基因和蛋白的表達，有效抑制心肌細(xì)胞凋亡，從而改善心功能。

綜上所述，黃芪注射液可以通過改善心肌細(xì)胞能量代謝和線粒體鈣離子轉(zhuǎn)運來抑制心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮細(xì)胞保護作用，從而達到緩解和治療心力衰竭的目的。但心力衰竭的發(fā)生機制十分復(fù)雜，僅心肌細(xì)胞凋亡即有3種通道途徑可以觸發(fā)，其中還涉及多種細(xì)胞凋亡因子和蛋白參與。本研究結(jié)果可以為黃芪注射液臨床防治心力衰竭提供應(yīng)用依據(jù)，但其具體的參與機制仍需進一步研究。