電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定陽春砂中多種無機(jī)元素

覃挺紅，黃海波，鐘慧怡，黃嘉鳳，但俊，陳玉娥

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006；2.廣州采芝林藥業(yè)有限公司，廣東廣州 510360）

陽春砂為姜科植物豆蔻屬陽春砂Amomum villosumLour.的干燥成熟果實(shí)，臨床上多用于濕濁中阻、脘痞不饑、脾胃虛寒、嘔吐泄瀉、妊娠惡阻、胎動(dòng)不安等病證[1]。陽春砂主要產(chǎn)于廣東、廣西和云南，其中，廣東陽春地區(qū)是陽春砂的道地產(chǎn)區(qū)。近年來，無序引種導(dǎo)致陽春砂的市場來源愈加混亂，且暫無可靠的方法用于區(qū)別不同產(chǎn)地的陽春砂，因此，需建立一種可有效判別不同產(chǎn)地陽春砂的方法。

植物體內(nèi)無機(jī)元素的組成和含量與其生長環(huán)境有直接的關(guān)聯(lián)性[2]。不同產(chǎn)地中藥材因水、土壤的結(jié)構(gòu)和種類等自然因素以及施肥種類和農(nóng)藥的使用等人為因素的差異，不同地域的同一品種藥材所含的元素組成和含量存在差異，以此可作為產(chǎn)地判別的依據(jù)。電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICPMS）法具有靈敏度高、檢測限低、線性范圍寬、干擾少等特點(diǎn)[3]，可對(duì)大部分元素進(jìn)行同步分析，近年來應(yīng)用于大米、果汁、金銀花、石斛等食品或中藥的無機(jī)元素測定[4-7]。本實(shí)驗(yàn)以ICP-MS測定陽春砂中多種無機(jī)元素，對(duì)陽春砂無機(jī)元素進(jìn)行分析，建立陽春砂產(chǎn)地判別模型，為陽春砂的安全性評(píng)價(jià)和產(chǎn)地判別提供參考數(shù)據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器與試劑MDS-6G微波消解儀（上海新儀微波化學(xué)科技有限公司，配聚四氟乙烯消解罐）；iCAP-RQ電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher公司）；GZX-9070MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；AUY120萬分之一分析天平（日本島津公司）。混合標(biāo)準(zhǔn)溶液[含鋁（Al）、砷（As）、硼（B）、鋇（Ba）、鉍（Bi）、鈣（Ca）、鎘（Cd）、鈷（Co）、鉻（Cr）、銅（Cu）、鐵（Fe）、鎵（Ga）、汞（Hg）、鉀（K）、鋰（Li）、鎂（Mg）、錳（Mn）、鉬（Mo）、鎳（Ni）、磷（P）、鉛（Pb）、銣（Rb）、銻（Sb）、硒（Se）、錫（Sn）、鍶（Sr）、釩（V）、鋅（Zn）]（GNM-M301629-2013，國家有色金屬及電子材料分析測試中心，500 μg·mL-1）；銠（Rh）標(biāo)準(zhǔn)溶液（GNM-M30725-2013，國家有色金屬及電子材料分析測試中心，100 μg·mL-1）；65%硝酸（優(yōu)級(jí)純，成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司）；30%過氧化氫（優(yōu)級(jí)純，廣州化學(xué)試劑廠）；調(diào)諧液（美國Thermo Fisher公司）；純氦氣（99.999%，廣州大成氣體有限公司）；高純氬氣（99.999%，廣州大成氣體有限公司）；超純水。

1.2 藥材本研究所收集的陽春砂干果來源于廣東、廣西和云南3個(gè)省區(qū)，樣品由廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥鑒定教研室黃海波副教授鑒定為姜科植物陽春砂Amomum villosumLour.的干燥成熟果實(shí)，憑證標(biāo)本保存于廣州中醫(yī)藥大學(xué)。所收集的干果用密封袋封裝，置于4℃冰箱中冷藏保存。樣品信息見表1。

表1 陽春砂樣品信息Table 1 Sample information of Amomum villosum Lour.

2 方法與結(jié)果

2.1 ICP-MS條件射頻功率為1 548 W；采樣深度為5 mm；蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速為40 r·min-1；噴霧室溫度為2.9℃；霧化器、輔助氣和冷氣流量分別為1.025 L·min-1、0.8 L·min-1和14 L·min-1；KED模式，測試前用調(diào)諧液進(jìn)行調(diào)諧，掃描30次，采集點(diǎn)數(shù)和重復(fù)次數(shù)均為3次。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)溶液制備精密吸取1 mL混合標(biāo)準(zhǔn)品，用5%稀硝酸稀釋至5 mL得到濃度為100 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)品母液；精密吸取30 μL內(nèi)標(biāo)溶液，用稀硝酸稀釋至100 mL得到濃度為30 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液，過0.45 μm水系濾膜。

2.2.2 供試品溶液制備樣品粉碎過50目篩，準(zhǔn)確稱取0.2 g樣品粉末于聚四氟乙烯消解罐內(nèi)，加入7 mL濃硝酸后蓋上密封，置于微波消解儀中并設(shè)置消解程序。第1步：150℃、10 min；第2步：180℃、20 min。待程序結(jié)束后降至室溫，于通風(fēng)櫥內(nèi)打開，用超純水潤洗密封蓋內(nèi)面并將潤洗液倒入罐內(nèi)。當(dāng)無棕色煙冒出且溶液呈無色透明時(shí)將消解液定容至50 mL。所得溶液過0.45 μm水系濾膜。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系和檢測下限取濃度100 μg·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用5%稀硝酸溶液為溶劑，逐級(jí)稀釋為5 000、2 000、1 000、500、200、100、50、20、10、5、2 ng·mL-1的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用ICP-MS測定各個(gè)元素響應(yīng)值，根據(jù)響應(yīng)值和濃度計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見表2。

表2 陽春砂各個(gè)無機(jī)元素檢測線性參數(shù)和檢測下限Table 2 Determination of linear parameters and detection lower limits of inorganic elements in Amomum villosum Lour.

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)取11號(hào)樣品粉末，準(zhǔn)確稱定0.2 g，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)方法制備樣品后，以“2.1”項(xiàng)儀器條件測量各元素含量，計(jì)算得各元素相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.85%~8.57%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn)取11號(hào)樣品粉末0.2 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備樣品，所得溶液用ICP-MS平行測定6次，測得各元素含量，計(jì)算得各元素RSD為0.80%~6.62%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.4 加樣回收試驗(yàn)因測量元素較多，本實(shí)驗(yàn)選取陽春砂低、中、高含量共5個(gè)元素進(jìn)行加樣回收試驗(yàn)，即B、Mg、Ga、Ba、Fe。準(zhǔn)確稱取已知含量的11號(hào)樣品粉末0.1 g，共30份，分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，每個(gè)元素平行6份。按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備樣品，測定各元素含量，計(jì)算得到B、Mg、Ga、Ba、Fe的平均加樣回收率分別為105.83%、97.66%、99.48%、97.20%、103.32%，RSD分別為4.19%、3.12%、2.87%、5.52%、1.99%。

2.4 樣品測定根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件，檢測3個(gè)省份陽春砂樣品中Al、As、B、Ba、Bi、Ca、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Ga、Hg、K、Li、Mg、Mn、Mo、Ni、P、Pb、Rb、Sb、Se、Sn、Sr、V、Zn的含量，結(jié)果見表3。其中，Hg未檢出，表中無列出。

表3 陽春砂無機(jī)元素測定結(jié)果Table 3 Results of determination of inorganic elements in Amomum villosum Lour.（μg·g-1，n=3）

（續(xù)表3）

（續(xù)表3）

2.5 結(jié)果與分析

2.5.1 陽春砂無機(jī)元素特征分析從表4可知：陽春砂中K元素含量最高，3個(gè)省份陽春砂的平均含量均在40 000 μg·g-1以上；其次為P和Mg元素，平均含量高于3 000 μg·g-1；陽春砂中Cd、Sb、Bi、Mo、Sn、Pb、Se、As、Ga、Co、V和Li的含量較低，均小于2 μg·g-1。應(yīng)用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)（K-W檢驗(yàn)）考察3個(gè)省份間各個(gè)元素含量的差異，并以k個(gè)獨(dú)立樣本的單因素方差分析對(duì)3個(gè)省份陽春砂中無機(jī)元素的含量進(jìn)行兩兩比較。結(jié)果表明：3個(gè)省份間除了V、Co、Mo、Sb、Fe、Ba、Pb、Bi的含量無顯著性差異（P＞0.05），其他元素均存在顯著性差異。當(dāng)P＜0.05時(shí)，廣東陽春砂中B、K、Ca、Cr、Cu、Zn、As、Rb、Sn的含量顯著高于廣西陽春砂，而Ni元素含量顯著低于廣西陽春砂；廣東陽春砂中Cd含量明顯高于云南陽春砂；云南陽春砂Li、B、Mg、Al、P、K、Ca、Cr、Cu、Zn、Ga、As、Se、Rb、Sr、Sn的含量顯著高于廣西陽春砂。

表4 3個(gè)省份陽春砂無機(jī)元素含量差異性分析Table 4 Analysis on the differences of contents of inorganic elements in Amomum villosum Lour.in three provinces （±s，μg·g-1）

表4 3個(gè)省份陽春砂無機(jī)元素含量差異性分析Table 4 Analysis on the differences of contents of inorganic elements in Amomum villosum Lour.in three provinces （±s，μg·g-1）

注：同行不同小寫字母表示存在顯著性差異（P＜0.05）

元素鋰（Li）硼（B）鎂（Mg）鋁（Al）磷（P）鉀（K）鈣（Ca）釩（V）鉻（Cr）錳（Mn）鐵（Fe）鈷（Co）鎳（Ni）銅（Cu）鋅（Zn）鈣（Ga）砷（As）硒（Se）銣（Rb）鍶（Sr）鉬（Mo）鎘（Cd）錫（Sn）銻（Sb）鋇（Ba）鉛（Pb）鉍（Bi）云南（n=17）0.484±0.492a 35.934±22.307a 21 223.496±14 221.612a 3 087.918±4 732.564a 30 208.718±23 976.056a 378 421.708±284 608.816a 3 035.964±2 018.232a 1.274±1.057a 175.199±71.656a 1 199.935±690.055a 579.100±323.265a 0.628±0.301a 12.577±6.209ab 18.900±2.634a 158.773±40.319a 0.481±0.508a 0.499±0.223a 0.415±0.227a 173.138±175.612a 57.273±46.981a 0.310±0.199a 0.026±0.015b 0.597±0.352a 0.028±0.013a 39.723±30.999a 0.238±0.376a 0.005±0.007a廣西（n=12）0.136±0.069b 9.851±5.554b 4 477.267±2 142.143b 472.599±468.173b 3 443.246±3 212.649b 48 335.919±49 859.719b 567.899±454.326b 0.951±1.050a 40.038±42.944b 680.478±725.313a 298.414±180.868a 0.819±0.349a 13.340±3.482a 13.833±1.653b 100.844±34.267b 0.164±0.130b 0.214±0.222b 0.211±0.176b 34.944±16.252b 21.457±19.848b 0.217±0.156a 0.031±0.162ab 0.079±0.116b 0.018±0.011a 33.417±35.707a 0.551±0.538a 0.004±0.005a廣東（n=10）0.301±0.261ab 30.610±19.248a 16 225.791±13 711.109ab 1 824.642±1 636.648ab 23 972.539±21 438.648ab 262 653.100±214 153.384a 2 300.354±1 792.625a 0.957±0.511a 148.459±75.786a 1 486.673±1 077.045a 458.783±221.191a 0.771±0.246a 8.440±2.515b 18.402±3.603a 170.543±56.244a 0.345±0.217ab 0.565±0.353a 0.459±0.558a 207.272±212.522a 64.327±56.400a 0.190±0.148a 0.047±0.026a 0.565±0.344a 0.036±0.025a 48.518±46.230a 0.507±0.507a 0.005±0.003a

2.5.2 陽春砂重金屬含量分析《藥用植物及制劑外經(jīng)貿(mào)綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》[8]中規(guī)定：Hg≤0.2 mg·kg-1，Pb≤5.0 mg·kg-1，As≤2.0 mg·kg-1，Cd≤0.3 mg·kg-1，Cu≤20.0 mg·kg-1。從表3可知：3個(gè)省份的陽春砂均未檢測出Hg，Pb、As、Cd在規(guī)定的限量范圍內(nèi)。廣東和云南有部分樣品的Cu超標(biāo)，廣東陽春砂Cu含量在12.18～25.52 mg·kg-1之間，有30%的樣品超標(biāo)；云南陽春砂Cu含量在13.45～23.35 mg·kg-1之間，有35%的樣品超標(biāo)。Cu含量超標(biāo)的原因不僅與當(dāng)?shù)赝寥酪蛩赜嘘P(guān)，還可能與含銅殺蟲劑的長期大量使用和城市污泥堆肥利用有關(guān)[9]；果實(shí)、種子類中藥材生長周期短，重金屬在其體內(nèi)富集時(shí)間較短[10]，故陽春砂中Cu含量超標(biāo)量不高。

2.5.3 3個(gè)省份的陽春砂產(chǎn)地判別分析采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)測定結(jié)果進(jìn)行逐步判別分析。從27種元素中篩選出具有顯著性差異的無機(jī)元素。將39份陽春砂樣品按照廣西、廣東、云南分為3組，構(gòu)建3個(gè)省份陽春砂產(chǎn)地判別模型，獲得3個(gè)省份的分類函數(shù)：廣西組=-0.053×Cr+0.391×Ni+1.482×Cu+0.083×Zn-17.094；廣 東組=-0.001×Cr-0.06×Ni+2.346×Cu+0.053×Zn-26.864；云南組=0.066×Cr+0.147×Ni+2.766×Cu-0.059×Zn-29.219。由函數(shù)可知，共有4種元素被引入到判別模型中，分別為Cr、Cu、Zn、Ni的含量值。利用建立的判別模型，3個(gè)省份判別分析的整體回判檢驗(yàn)正確率和交叉驗(yàn)證率分別為87.2%和84.6%。具體結(jié)果見表5。

表5 3個(gè)省份陽春砂的判別結(jié)果Table 5 Discriminant results of Amomum villosum Lour.in three provinces （%）

2.5.4 4個(gè)采集地的陽春砂產(chǎn)地判別分析進(jìn)一步選取樣品數(shù)較多的4個(gè)采集地陽春砂（陽春、崇左、文山和西雙版納）進(jìn)行逐步判別分析，獲得4個(gè)分類函數(shù)：陽春組=0.057×Ni+2.813×Cu-8.399×Sn-26.223；崇左組=0.681×Ni+2.094×Cu-2.831×Sn-21.843；文山組=0.154×Ni+2.332×Cu-2.831×Sn-21.843；西雙版納組=0.501×Ni+2.987×Cu-11.642×Sn-32.983。由函數(shù)可知共有3種元素被引入到判別模型中，分別為Cu、Ni、Sn的含量值。4個(gè)采集地判別分析的回判檢驗(yàn)正確率和交叉驗(yàn)證率分別為79.3%和72.4%。具體結(jié)果見表6。

表6 陽春砂4個(gè)采集樣地?zé)o機(jī)元素判別結(jié)果Table 6 Discrimination results of inorganic elements in Amomum villosum Lour.from 4 habitats （%）

3 討論

目前，用于產(chǎn)地溯源的技術(shù)主要包括穩(wěn)定同位素分析技術(shù)、無機(jī)元素分析技術(shù)和有機(jī)化合物分析技術(shù)等[11]。本研究K-W檢驗(yàn)和逐步判別分析表明，不同產(chǎn)地陽春砂中無機(jī)元素含量存在差異，可以根據(jù)差異構(gòu)建陽春砂的判別模型。以3個(gè)省份逐步判別分析篩選出的4個(gè)差異性指標(biāo)可對(duì)3個(gè)省份陽春砂有較好區(qū)分結(jié)果；以4個(gè)采集地（陽春、崇左、文山和西雙版納）篩選出的3個(gè)差異性指標(biāo)建立的產(chǎn)地判別模型總體準(zhǔn)確率不高，但崇左和文山產(chǎn)區(qū)具有較好的判別結(jié)果，回判檢驗(yàn)和交叉驗(yàn)證的正確率均在85%以上。說明以無機(jī)元素建立陽春砂的產(chǎn)地判別模型對(duì)不同產(chǎn)地陽春砂進(jìn)行區(qū)分具有一定的應(yīng)用潛力。為提高產(chǎn)地判別模型的準(zhǔn)確性，前人將穩(wěn)定同位素分析技術(shù)、無機(jī)元素分析技術(shù)或有機(jī)化合物分析技術(shù)等結(jié)合應(yīng)用，以獲得更多差異性指標(biāo)，并取得一定的成果[12-14]，提示結(jié)合多種產(chǎn)地溯源技術(shù)構(gòu)建具有更準(zhǔn)確的陽春砂產(chǎn)地判別模型的可能性。

本實(shí)驗(yàn)前期曾通過正交設(shè)計(jì)探討固液比、過氧化氫和濃硝酸的比例及消解時(shí)間對(duì)陽春砂消解處理的影響，從中發(fā)現(xiàn)固液比對(duì)樣品的消解程度影響較大，較多消解溶劑與樣品充分反應(yīng)能更徹底地裂解有機(jī)物而提高含量測定的準(zhǔn)確率。最終優(yōu)選的陽春砂消解條件為0.2 g樣品中加入7 mL濃硝酸，180℃下消解時(shí)間為20 min。

應(yīng)用ICP-MS法測定陽春砂中28種無機(jī)元素，檢測限低，精密度和重復(fù)性良好，可用于同時(shí)對(duì)陽春砂中多種無機(jī)元素的快速檢測。由于工作條件等原因，本研究僅以陽春砂中無機(jī)元素的含量進(jìn)行產(chǎn)地判別。但植物中無機(jī)元素的含量不僅與產(chǎn)地土壤相關(guān)，還可能受農(nóng)藥、施肥等栽培管理的影響[15]。研究表明，陽春砂栽培中會(huì)施加含多種元素的肥料以及防治病蟲害的農(nóng)藥[16-18]。不同種類及含量的農(nóng)藥、肥料的應(yīng)用可能會(huì)影響陽春砂無機(jī)元素的積累。提示未來應(yīng)進(jìn)一步收集不同產(chǎn)地土壤樣本及開展種植實(shí)驗(yàn)，探討陽春砂中無機(jī)元素的富集效應(yīng)以及肥料、農(nóng)藥等栽培管理因素對(duì)陽春砂中無機(jī)元素含量的影響，以解決銅超標(biāo)問題，提高陽春砂品質(zhì)。