多配體蛋白聚糖4在骨關節炎中的作用機制研究進展

陳曉華 于世賓

骨關節炎(osteoarthritis, OA)是一種導致骨關節結構漸進性破壞的退行性疾病，癥狀主要包括關節疼痛和運動障礙等，嚴重影響生活質量。據統計,≥60歲人群中約37%罹患OA[1]。OA暫時沒有治愈的療法，目前早期以保守治療為主，晚期多需要關節置換。OA的主要病理學表現包括軟骨退行性變、軟骨下骨吸收/硬化/骨贅形成和滑膜炎癥等，目前其具體發病機制尚不明確[1～4]。

關節軟骨主要是由膠原、蛋白多糖等構成的軟骨細胞外基質(extracellular matrix，ECM)和軟骨細胞構成的，軟骨基質降解和軟骨細胞死亡是軟骨退變的核心病理事件，因此軟骨基質與軟骨細胞之間的交互是關節軟骨穩態維持的重要因素。硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulphate proteoglycan，HSPG)是一組Ⅰ型跨膜蛋白聚糖，直接連接軟骨細胞外基質和軟骨細胞，是軟骨基質與軟骨細胞之間交互的重要紐帶(圖1)。研究表明，HSPG可以通過調控細胞增殖、分化、黏附和遷移等活動在多種組織的生長發育、傷口愈合及腫瘤進展中發揮著重要作用[5]。HSPG由1條核心蛋白質與多條氨基聚糖(glycosaminoglycan，GAG)側鏈共價結合而成，其核心蛋白橫跨細胞膜并與細胞膜緊密結合[6]；其GAG側鏈則位于細胞外，主要有硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，HS)、硫酸軟骨素(chondroitin sulfate，CS)2種側鏈。HSPG家族成員主要包括多配體蛋白聚糖(syndecan，SDC)1～4，其中SDC1和SDC3通常具有3～5個硫酸乙酰肝素或硫酸軟骨素側鏈，SDC2和SDC4則只含有硫酸乙酰肝素側鏈。SDC1～4都表達于關節軟骨中，其中目前研究最多、相對清楚的是SDC4，本文就SDC4在OA中的作用機制進行回顧[7]。

圖1 硫酸乙酰肝素蛋白多糖家族成員及結構

一、SDC4簡介

SDC4是HSPG家族中最小的成員，相對分子質量約為22kDa，表達于哺乳動物大多數組織中[8,9]。SDC4的結構主要由N-末端胞外區、跨膜區和胞內區3部分構成。

1.胞外區:SDC4胞外區的核心蛋白大約由120個氨基酸構成，從胞外游離端向細胞膜方向分為HS側鏈結合域、細胞結合域和剪切位點域3部分[10]。SDC4核心蛋白N-末端的HS側鏈結合域位點能通過共價鍵與3條HS側鏈相連接，SDC4通過其HS側鏈能與包括細胞外基質糖蛋白[如纖維粘連蛋白(fibronectin)]、膠原、細胞因子[如成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)、骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein 2，BMP2)和Wnt等]、趨化因子等在內含有肝素結合域的多種配體相互作用，發揮生物學效應[11,12]。SDC4胞外核心蛋白的細胞結合域大約位于胞外區第56～109號氨基酸，其能與其他細胞的表面分子結合，從而參與介導細胞與細胞、細胞與ECM的黏附[9,10]。SDC4胞外區的近胞膜端有剪切位點，SDC4胞外段在一定條件下可經基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)、蛋白凝血酶和纖維蛋白溶解酶等的剪切，脫落到細胞外基質中。SDC4胞外段的脫落不僅會顯著降低原軟骨細胞的信號轉導能力，釋放到基質中的可溶性SDC4胞外段仍然具有結合生長因子的能力，還可以以自分泌、旁分泌的形式作為激動劑或抑制劑發揮作用；可溶性SDC4胞外段還可以進入滑液、血液等被運送到其他部位發揮作用。

2.跨膜區：SDC4的跨膜區在細胞膜上呈單跨度疏水螺旋結構，跨膜結構域包含一個GXXXG的二聚化基序，驅動SDC4二聚化[13]。研究表明，十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)可以促進SDC4的二聚體形成[14]。SDC4在細胞黏著斑的形成中發揮著重要作用，如果用亮氨酸替代SDC4跨膜區GXXXG二聚化基序中的甘氨酸，不但會阻斷SDC4跨膜區的二聚化，還會降低下游RhoA(ras homolog family member A)的活化并影響后續的黏著斑形成、細胞黏附能力，促進細胞遷移[15]。此外，SDC4的跨膜區還可以通過誘導其胞內區的寡聚化來調控細胞內的信號傳遞[16]。

3.胞內區:SDC4的胞內區含有28個氨基酸殘基，由近端保守區域(C1)、可變區(V)及遠端保守區域(C2)構成[5]。C1區鄰近細胞膜，參與SDC4二聚化，并結合tubulin、cortactin等胞內蛋白；C2 區為SDC4羧基末端區，包含95盤狀突觸后密度大帶狀皰疹閉合區-1(postsynaptic density 95-disk large zona occludens-1，PDZ)結合區，能夠通過PDZ銜接蛋白結合形成多分子復合體，錨定于細胞骨架上，參與信號轉導[17]。V區含有磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸[phosphatidylinositol(4,5)bisphosphate 2,PIP2]結合位點，當V區與PIP2結合后，SDC4會發生二聚化，同時激活下游的蛋白激酶Cα(protein kinase Cα，PKCα)，啟動下游信號轉導[18]。由此可見，作為一種同時連接軟骨細胞外基質和軟骨細胞的跨膜蛋白，SDC4與細胞外基質、細胞骨架、細胞因子和通路蛋白之間存在廣泛的聯系，參與多種細胞學活動。

二、SDC4對OA病變嚴重程度的影響

2009年Echtermeyer等[7]研究指出，人膝關節OA軟骨的表面帶中有80%的軟骨細胞強表達SDC4，SDC4的表達與OA的嚴重程度呈正相關，而且，特異性敲除SDC4或在小鼠關節腔注射SDC4抗體可以顯著降低小鼠前交叉韌帶切除所誘導的關節軟骨OA病理評分以及蛋白多糖的丟失量，維持關節軟骨的厚度。2021年Zhou等[19]向8～10周齡手術誘導膝OA的雄性小鼠關節腔內注射SDC4特異性抗體，結果也證實特異性SDC4抗體可以顯著延緩OA軟骨的破壞和降解。2019年Sanchez等[20]研究表明，體外分化的肥大化軟骨細胞較未肥大化細胞表達更多的SDC4，而且多數OA軟骨細胞的體外培養上清中存在SDC4。徐傳慧等[21]研究發現，OA患者血液中的SDC4、MMP13、血小板結合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶5(a disintegrin and metalloproteinase with a thrombospondin type 1 motif, member5，ADAMTS5)和Ⅱ型膠原片段的水平與OA嚴重程度呈正相關，其中SDC4的相關性最高。2021年Bollmann等[2]研究表明，OA患者關節滑液中脫落的SDC4胞外段水平顯著升高，且與OA嚴重程度呈正相關，并提出脫落的SDC4水平可以作為反映OA軟骨降解程度的重要標志物。

椎間盤的髓核是位于軟骨板和纖維環之間由軟骨細胞和纖維網狀結構組成的彈性膠凍樣結構[22]。在健康人和大鼠椎間盤中SDC4表達較低，而OA樣退變椎間盤組織中，隨著病理程度的加重，SDC4的mRNA和蛋白水平表達顯著升高，蛋白聚糖降解增多。Ge等[23]在兔椎間盤髓核細胞體外構建SDC4過表達和低表達模型結果發現，SDC4過表達時聚集素和Ⅱ型膠原的表達水平顯著降低，軟骨退變標志物Ⅹ型膠原的水平顯著升高，而在SDC4被敲低的細胞中，這一作用被逆轉；在體內通過外科手術構建的兔椎間盤退變模型，SDC4小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)注射組的Ⅱ型膠原和聚集素的表達顯著升高。

由此可見，SDC4既是維持軟骨基質與軟骨細胞正常交互的重要結構基礎，又是參與OA發生、發展的核心蛋白，抑制SDC4的表達，有助于逆轉OA軟骨的退行性變。

三、SDC4與OA相關細胞因子之間的相互影響

盡管OA的發病機制尚不明確，但越來越多的證據表明，細胞因子在其發生、發展中發揮著重要作用，其中白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、MMPs、ADAMTSs、低氧誘導因子(hypoxia inducible factor, HIF)、VEGF、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)等都是OA相關的明星細胞因子。

1.SDC4與IL-1β：IL-1β是OA病理生理過程中主要的炎性細胞因子之一，通過增加基質降解關鍵酶的表達和活性，對軟骨有明顯的分解代謝作用[24]。Wang等[25]用10ng/ml的IL-1β刺激成熟大鼠髓核細胞，進行RT-PCR和Western blot法檢測分析發現，SDC4的mRNA和蛋白表達水平均顯著升高。L?fgren等[26]在馬掌骨關節軟骨塊的體外培養體系中加入IL-1β，通過基因芯片等檢測發現，在第3、9、15、21和27天時，與未刺激的外植體比較，SDC4的基因表達顯著上調。Bollmann等[2]用不同濃度的IL-1β(0.1、1和10ng/ml)刺激人膝軟骨細胞，通過ELISA檢測發現，培養體系中SDC4胞外段的脫落量與IL-1β刺激濃度呈正相關。Zhou等[19]在體外用SDC4特異性抗體預處理原代小鼠膝關節軟骨細胞2h，再用IL-1β刺激軟骨細胞4h，結果發現SDC4抗體可以顯著抑制IL-1β所誘導的軟骨細胞肥大化相關因子Ⅹ型膠原(type Ⅹ collagen，Col Ⅹ)、MMP13、RUNX2(runt-related transcription factor 2)和ADAMTS5等的表達。由此可見，OA關鍵炎性細胞因子IL-1β可以顯著上調退變軟骨內SDC4的表達水平及SDC4胞外段的脫落水平，抑制SDC4的效應可以在一定程度上抑制IL-1β對軟骨細胞的效應。

2.SDC4與TNF-α:TNF-α是OA進程中另一種重要的炎性細胞因子，其可以刺激軟骨細胞中IL-1β、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)等其他炎性細胞因子以及MMPs等基質降解酶的分泌，進一步加重軟骨退變。Yang等[27]采用不同濃度(10、25和50ng/ml)的TNF-α刺激大鼠髓核細胞，結果發現，大鼠髓核細胞中的SDC4表達顯著上調，在培養體系中加入ERK1/2和NF-κB的抑制劑可以顯著逆轉TNF-α刺激所誘導的SDC4表達上調。Wu等[28]也證實25和50ng/ml的TNF-α刺激人髓核細胞6、12和24h時，細胞中SDC4的表達顯著高于對照組，且隨時間延長逐漸升高。由此可見，OA關鍵炎性細胞因子TNF-α也可以顯著上調對退變軟骨內SDC4的表達水平。

3.SDC4與MMPs：MMPs是一組鋅與鈣離子依賴性的肽鏈內切酶，其主要生物學功能就是降解細胞外基質，OA發生時MMPs表達異常增高是軟骨細胞外基質合成與降解失衡的重要原因。2009年，Echtermeyer等[7]研究發現，與野生型OA小鼠比較，SDC4-/-小鼠OA軟骨中MMP3的表達顯著降低；通過向野生型OA小鼠的關節腔注射SDC4特異性抗體也可以顯著降低關節軟骨中MMP3的表達水平；同時，與野生型軟骨組織塊比較，體外在IL-1β刺激下SDC4-/-軟骨組織塊中的MMP3表達和ERK1/2磷酸化水平顯著降低，提示SDC4可能是通過調控ERK1/2的磷酸化進而影響MMP3的表達。2014年Wang等[29]研究發現，SDC4 shRNA可以顯著下調TNF-α和IL-1β所誘導的髓核細胞中的MMP3表達水平，而且髓核細胞中TNF-α依賴性MMP3上調可能是通過TNFR1-MAPK-NF-κB通路介導的。2021年Bollmann等[2]通過ELISA方法檢測了OA患者滑液中的MMP9、MMP2、SDC4水平，結果發現，MMP9、SDC4隨著OA患者等級加重而升高，滑液中脫落的SDC4量與MMP9的水平呈正相關；在人原代軟骨細胞培養體系中加入MMP9特異性抑制劑，可以將IL-1β刺激所誘導的SDC4脫落量降低約59.3%；應用siRNA敲低軟骨細胞中的MMP9也可以顯著降低IL-1β刺激所誘導的SDC4脫落量。由此可見，MMP9可能是SDC4相關的脫落酶，而軟骨細胞中SDC4的表達又會反過來影響MMP3的表達，SDC4與MMPs之間存在密切的相互聯系。

4.SDC4與ADAMTS-5：ADAMTS-5作為軟骨中聚集蛋白聚糖的主要裂解酶，在OA軟骨退變中發揮著重要作用。Echtermeyer等[7]研究發現，特異性敲除小鼠SDC4或向野生型OA小鼠的關節腔注射抗SDC4特異性抗體可以顯著降低關節軟骨中ADAMTS降解產物——蛋白聚糖片段(aggrecan neoepitope)的表達水平，與ADAMTS-5-/-小鼠的表型幾乎完全一致；此外SDC4能通過HS鏈直接與ADAMTS-5結合來激活ADAMTS-5的活性，但并未直接上調軟骨中ADAMTS-5的表達水平。Wang等[25]研究發現，在退變的人椎間盤組織以及炎性細胞因子TNF-α或IL-1β刺激的髓核細胞中SDC4和ADAMTS4、ADAMTS-5的表達水平均顯著增高；免疫共沉淀實驗證實SDC4可以直接與ADAMTS-5而非ADAMTS4結合，應用肝素酶Ⅲ裂解髓核細胞SDC4的硫酸乙酰肝素鏈可以顯著增高培養液中ADAMTS-5前體的水平；SDC4表達水平的升高會將ADAMTS-5結合并錨定在細胞表面，并將其激活，活化的ADAMTS-5加速細胞外基質降解。由此可見，TNF-α或IL-1β等炎性細胞因子所誘導的SDC4表達升高可以結合并激ADAMTS-5的活性，從而促進細胞外基質中蛋白聚糖的降解。

5.SDC4與其他軟骨相關因子:Sox9(sex-deter-mining region Y-box 9)是蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的關鍵轉錄調節因子[22,30]。Ge等[23]研究發現，通過基因轉染上調髓核細胞中的SDC4后髓核細胞中Sox9水平顯著降低，而敲低SDC4的表達髓核細胞中Sox9的表達水平會顯著升高，該結果與Fujita等[31]的研究結果一致。HIF在是基因轉錄水平調控組織細胞對缺氧微環境反應的一類核轉錄因子。在低氧條件下，HIF能與低氧反應元件(hypoxic response element，HRE)結合激活靶基因。Fujita等[31]研究發現，在低氧環境下椎間盤髓核細胞中含有HRE元件的SDC4啟動子活性明顯上調；通過基因轉染使髓核細胞中的HIF-1α過表達可以顯著上調SDC4的表達水平，而通過shRNA敲低HIF-1α和HIF-1β的表達可以顯著抑制SDC4的表達。Zhou等[19]研究發現，在小鼠骨關節炎模型的關節腔注射SDC4特異性抗體，或者在體外IL-1β所刺激的軟骨細胞培養體系中加入SDC4特異性抗體，均可顯著抑制HIF-2α的表達，同時逆轉OA小鼠的軟骨退變進程。Yang等[27]在加入或不加入10ng/ml TGF-β1的情況下，用25ng/ml TNF-α處理大鼠髓核細胞，結果發現，TGF-β1可以抑制TNF-α所誘導的SDC4表達升高。

四、總結與展望

綜上所述，作為一種連接軟骨細胞和胞外基質的橋梁分子，SDC4在OA發生、發展中的重要作用已經引起了廣大研究者的關注，大量研究表明，SDC4與IL-1β、TNF-α、MMPs、ADAMTSs、Sox9、HIF、TGF-β1等一起在OA的發生、發展中起重要作用，但其具體分子機制尚不明確。闡明SDC4參與OA發生、發展的關鍵分子機制，尋找SDC4相關的OA治療靶點，有望揭示OA的發病機制，并為OA的靶向治療提供新策略。