姜黃素對阿爾茨海默病模型大鼠海馬區(qū)GSK3β蛋白表達(dá)的影響

俞柏翎 葉茂盛 潘 鋒 周 勇 酈旦明

近年來隨著社會的不斷發(fā)展進(jìn)步及生活質(zhì)量的不斷提高，老年人口與日俱增，對老年疾病的診療成為社會關(guān)注的熱點話題之一。阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)是以慢性、進(jìn)行性記憶功能受損、認(rèn)知功能紊亂及行為改變?yōu)樘攸c，占所有癡呆的2/3以上，其發(fā)生率逐年上升，嚴(yán)重程度隨著年齡增長而加劇，已是老年人最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病之一[1]。至今，尚無有效手段能逆轉(zhuǎn)或阻止AD疾病進(jìn)展，因此尋求能減緩甚至阻斷病情發(fā)展的藥物具有重要意義。

姜黃素是一種多酚類色素，因其具有多種生物活性，能發(fā)揮多靶點治療作用，已被廣泛應(yīng)用于實驗研究。近年來研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能改善AD模型動物的認(rèn)知功能，發(fā)揮抑制Aβ肽的生成和沉積、清除自由基、減輕神經(jīng)炎性反應(yīng)等作用[2]。糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase3β，GSK3β)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控Aβ生成、tau蛋白磷酸化及細(xì)胞凋亡等參與了AD的病理生理過程。本實驗擬比較不同劑量的姜黃素對AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的影響，探討姜黃素對AD模型大鼠海馬區(qū)GSK3β蛋白表達(dá)的影響。

材料與方法

1.實驗材料：姜黃素(CAS號：458-37-7，批號：15051512，純度>98%)購自上海遠(yuǎn)慕生物工程公司；Aβ1-42Antibody Blocking Peptide(Aβ1-42)(批號：05186048，編號bs-0107p)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，兔抗GSK-3β(貨號：12456S)購自美國CST公司，β-actin(貨號：4970S)購自美國CST公司，注射用青霉素鈉購自哈藥集團(tuán)制藥總廠；DAB顯色試劑盒、免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；實驗所需相關(guān)儀器包括圖像分析系統(tǒng)、鼠腦立體定位、Morris水迷宮系統(tǒng)等由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗室提供。

2.動物選擇及分組：清潔級SD雄性大鼠60只，體質(zhì)量為180～220g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗室提供，動物實驗條件合格證：SYXK(浙)2013-0184。本實驗由浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會審批后進(jìn)行。經(jīng)過1周的適應(yīng)性喂養(yǎng)后，按照數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，即假手術(shù)組、Aβ模型組、低劑量姜黃素干預(yù)組(L-CU組)和高劑量姜黃素干預(yù)組(H-CU組)。

3.模型建立及給藥：Aβ1-42(濃度為10g/L)溶于無菌PBS(pH=7.4)，37℃下儲存孵育1周。大鼠經(jīng)10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉后,將大鼠頭固定于腦立體定位儀，常規(guī)備皮消毒，顱頂部正中切開皮膚，暴露前囟，選擇大鼠右側(cè)海馬CA1區(qū)作為注射靶區(qū)，定位點參照《大鼠腦立體定位圖譜》，選擇前囟后3.0mm，右側(cè)旁開2.2mm[3]。微量注射器對準(zhǔn)靶點，緩慢進(jìn)針，深度為2.5～3.0mm，假手術(shù)組注射滅菌生理鹽水1μl，模型組和干預(yù)組注射Aβ1-42溶液1μl，為使注射液能充分彌散，留針5min后退針，常規(guī)消毒縫合切口，術(shù)后3天予青霉素肌內(nèi)注射防止感染。術(shù)后正常飼養(yǎng)30天，假手術(shù)組、模型組給予0.9%NaCl溶液灌胃，L-CU組給予150mg/kg劑量姜黃素灌胃，H-CU組給予300mg/kg劑量灌胃。

4.Morris水迷宮測試：將大鼠從任意象限放入水迷宮系統(tǒng)，大鼠將在水中尋找水面下的平臺，記錄大鼠找到平臺所需的時間，即逃避潛伏時間，每只大鼠將進(jìn)行連續(xù)6天訓(xùn)練，3次/天，2分/次，如果2min內(nèi)大鼠未找到平臺，則記錄其逃避潛伏時間為2min。第7天將平臺撤除,將大鼠從任意水點放入水中，觀察3min內(nèi)的游泳軌跡，記錄大鼠穿越原平臺的次數(shù)，考察大鼠的學(xué)習(xí)記憶力。

5.標(biāo)本制作及觀察指標(biāo)：Morris水迷宮實驗完成后，采取10%水合氯醛腹腔麻醉并處死大鼠，以37℃ 0.9%NaCl溶液快速沖洗，立即投入4%多聚甲醛PBS溶液中灌注30min，剝離出海馬組織，經(jīng)4℃的4%多聚甲醛溶液固定48h，常規(guī)脫水處理，石蠟包埋，選取矢狀切面切片(厚度4μm)。通過HE染色法觀察比較各組大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；采用兩步法進(jìn)行免疫組化染色，脫蠟脫水，PBS沖洗，一抗為GSK3β(1∶150)，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。在400倍顯微鏡下，用圖像分析系統(tǒng)采集圖像，對海馬CA1區(qū)GSK3β蛋白表達(dá)陽性神經(jīng)細(xì)胞單位面積和平均吸光度值進(jìn)行分析。

6.采用Western blot法檢測GSK3β蛋白表達(dá):提取5只大鼠海馬組織，加入裂解液中提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。取50μg樣本進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉2h，按1∶1000稀釋兔抗GSK3β和β-actin，4℃孵育過夜，二抗HRP標(biāo)記山羊抗兔(1∶2000)孵育2h，上述過程用TBST洗滌3次，DAB顯色，以目的條帶與β-actin灰度值的比值作為蛋白的相對表達(dá)量。

結(jié) 果

1.大鼠Morris水迷宮實驗結(jié)果比較：與假手術(shù)組比較，Aβ模型組逃避潛伏時間增加，穿越平臺次數(shù)減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與Aβ模型組比較，L-CU組和H-CU組逃避潛伏時間均增加，穿越平臺次數(shù)均減少(P<0.05)。與L-CU組比較，H-CU組穿越平臺次數(shù)增加，逃避潛伏時間減少(P均<0.05，表1)。

表1 4組大鼠Morris水迷宮實驗結(jié)果比較

2.大鼠海馬HE染色結(jié)果比較：假手術(shù)組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞層次排列緊密，分布均勻，邊界整齊，細(xì)胞核圓形，核仁清晰，胞質(zhì)清亮。Aβ模型組海馬神經(jīng)細(xì)胞皺縮，分布散亂，間隙增大，數(shù)目明顯減少，細(xì)胞核固縮并且濃染，核仁消失，胞質(zhì)中出現(xiàn)明顯空泡征。姜黃素干預(yù)組神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目減少，分布散亂，胞質(zhì)量少而濃染，部分細(xì)胞核體積變小，呈橢圓形，核仁消失，詳見圖1。

圖1 4組大鼠海馬HE染色結(jié)果比較(HE，×200)

3.大鼠海馬GSK3β蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞結(jié)果比較：Aβ模型組海馬區(qū)GSK3β蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞量較假手術(shù)組明顯增加。L-CU組、H-CU組與Aβ模型組比較，GSK3β蛋白陽性細(xì)胞表達(dá)均減少，且H-CU組更明顯，詳見圖2。

圖2 4組大鼠海馬GSK3β蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞結(jié)果比較(IHC，×400)

4.大鼠GSK3β蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞的陽性單位面積、平均吸光度值結(jié)果比較：與假手術(shù)組比較，Aβ模型組GSK3β蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞的陽性單位面積、平均吸光度值增加(P<0.01)；L-CU組、H-CU組與Aβ模型組比較，GSK3β蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞的陽性單位面積、平均吸光度值減少(P<0.01)；與L-CU組比較，H-CU組GSK3β蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞的陽性單位面積、平均吸光度值減少(P<0.01，表2)。

表2 4組大鼠GSK3β蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞的陽性單位面積、平均吸光度值結(jié)果比較

5.大鼠Western blot法檢測GSK3β蛋白表達(dá)結(jié)果比較：Aβ模型組與假手術(shù)組比較，GSK3β蛋白表達(dá)增強(qiáng)；L-CU組、H-CU組與Aβ模型組比較，GSK3β蛋白表達(dá)均有減弱，詳見圖3。

圖3 4組大鼠Western blot法檢測GSK3β蛋白表達(dá)結(jié)果比較

討 論

至今對AD的發(fā)病原因及機(jī)制均尚未完全闡明，腦大體病理呈現(xiàn)出彌漫性腦萎縮，鏡下病理改變包括tau蛋白異常磷酸化形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFTs)，廣泛神經(jīng)元損傷缺失、Aβ沉積形成老年斑(SPs)、軸突及突觸功能障礙。中藥單體姜黃素具有抑制炎性細(xì)胞因子、抗氧化、抗細(xì)胞凋亡等復(fù)合特性，因為其藥理作用廣泛、分子靶點眾多、毒性不良反應(yīng)小、安全性良好，已用于多種疾病的預(yù)防與治療[4]。近期研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能改善認(rèn)知功能，減少細(xì)胞凋亡，起到神經(jīng)保護(hù)作用，有望為AD等神經(jīng)退行性疾病的治療提供新思路[5～7]。

正常情況下，淀粉樣前驅(qū)蛋白(amyloid precursor protein，APP)經(jīng)過β-分泌酶作用，產(chǎn)生C-末端片段(CTF-99)，γ-分泌酶裂解該片段，產(chǎn)生β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)，Aβ可以通過自噬降解、血-腦脊液屏障轉(zhuǎn)運(yùn)等途徑清除，當(dāng)大量Aβ生成，超過自身清除能力或降解功能受損時，就會導(dǎo)致Aβ聚集，產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。研究顯示，過量沉積的Aβ會導(dǎo)致線粒體功能障礙,引起突觸丟失、神經(jīng)元紊亂，推動了AD病程發(fā)展[8,9]。另一方面，Aβ可以通過多種途徑介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷、凋亡或壞死[10]。本實驗也證明了上述觀點，大鼠在注射Aβ溶液后出現(xiàn)空間記憶和學(xué)習(xí)能力減退。姜黃素干預(yù)組與模型組比較，逃避潛伏時間均減少、跨越平臺次數(shù)均增多，H-CU組要優(yōu)于L-CU組，且姜黃素的劑量與改善認(rèn)知、緩解AD發(fā)展的作用呈正相關(guān)。

海馬是大腦中與認(rèn)知、記憶等功能密切相關(guān)的重要區(qū)域之一，正常情況下，神經(jīng)元不斷產(chǎn)生替換凋亡或壞死的神經(jīng)元，而AD患者海馬萎縮及海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞生成能力下降，細(xì)胞信號傳遞紊亂，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙、學(xué)習(xí)記憶能力下降[11]。本研究中HE染色結(jié)果證實，過量Aβ可致神經(jīng)細(xì)胞元數(shù)目減少，細(xì)胞損傷，而注射不同濃度姜黃素后神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)較模型組明顯改善，提示姜黃素可呈濃度依賴性減輕海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷，猜測可能是與姜黃素具有增強(qiáng)SOD活性、抑制炎性細(xì)胞因子的作用相關(guān)。

研究證實，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)信號通路能調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞分化、生長、凋亡等過程[12,13]。糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase3β，GSK3β)在海馬區(qū)高度表達(dá)，是PI3K/Akt信號通路的核心部分。Gandy等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在AD模型小鼠腦組織的NFTs中可以檢測出較高表達(dá)的GSK3β蛋白。Ly等[15]研究表明，抑制GSK3β蛋白的活性可以降低APP水解途徑，減少Aβ的形成，清除異常積聚的Aβ。有研究證實姜黃素同時參與Aβ沉積過程及tau蛋白過度磷酸化，通過抑制GSK3β蛋白活性，可以阻斷PI3K/Akt/GSK3信號通路，起到緩解神經(jīng)細(xì)胞損傷，減緩AD發(fā)展的作用[16]。因而尋求能有效抑制GSK3β過度表達(dá)的藥物成為研發(fā)AD治療的新思路，本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬區(qū)GSK3β高表達(dá)，而姜黃素干預(yù)后，GSK3β蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞的陽性單位面積減少、平均吸光度值降低，說明姜黃素可能是通過抑制了GSK3β蛋白的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的作用，而GSK3β是PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游的關(guān)鍵蛋白，姜黃素改善認(rèn)知的作用可能與該信號通路相關(guān)。

綜上所述，姜黃素可能通過PI3K/Akt/GSK3介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少GSK3β蛋白表達(dá)，從而修復(fù)AD模型大鼠海馬區(qū)損傷的神經(jīng)細(xì)胞，具有改善認(rèn)知功能的作用，并且這種作用與姜黃素濃度相關(guān)。