拓撲異構酶Ⅱ在81例腦膠質瘤中的表達及意義

陰魯鑫 徐偉文 許 儒 張 奇 陳 洋

神經膠質瘤是一種起源于神經膠質細胞的顱內腫瘤，是最常見的原發性顱內腫瘤。全球每年有近10萬名新診斷患者[1]。WHO將膠質瘤分為4級，4級又稱膠質母細胞瘤，是人類所有類型腫瘤中預后最差的一種。其高致殘率和病死率嚴重影響人們的生活質量，威脅人們的生命[2]。在診斷出惡性膠質瘤的成年人中，超過2/3的人在診斷后2年內死亡[3]。目前人腦膠質瘤采用的是手術切除、輔助放化療和免疫治療的綜合方法[4,5]。由于易侵犯相鄰組織，瘤體常與鄰近組織界限不清，全切難度高，易再發等特點，腦惡性腫瘤的治療始終是人類醫學史上的一個重大挑戰。因此基因檢測與治療成為當今世界研究膠質瘤的熱門話題。研究表明拓撲異構酶Ⅱ(topoisomerase Ⅱ, TOPⅡ)作為腫瘤標志物，與膠質瘤發生、發展密切相關，提示其表達與惡性程度與預后相關[6]。本研究采取回顧性分析，研究拓撲異構酶Ⅱ在不同級別腦膠質瘤中的表達及相關性，分析其與膠質瘤臨床病理因素的相關性，并探討TOPⅡ在膠質瘤中的臨床價值。

材料與方法

1.材料:收集2015年10月～2017年12月徐州醫科大學附屬醫院腦外科膠質瘤標本81例，其標本結果已經由病理科證明。標本均為第1次在筆者醫院行手術取得。標本中男性患者44例，女性患者37例，患者年齡11～74歲，平均年齡為52.65±13.11歲。低惡度膠質瘤(WHOⅡ級)28例(34.57%)，包括少突膠質細胞瘤9例、星形細胞瘤19例；高惡度膠質瘤(Ⅲ～Ⅳ級)53例(65.43%)，包含間變性星形細胞瘤16例、膠質母細胞瘤37例。

2.試劑與方法：即用型鼠抗人TOPⅡ單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司，DAB顯色劑、EDTA pH 8.0修復液、PBS緩沖液、二抗均購自羅氏診斷產品上海有限公司。標本常規10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，4μm厚連續切片，分別行HE及免疫組化Envision法染色，染色步驟按步驟說明書嚴格進行。PBS代替一抗做陰性對照。

3.免疫組化評判標準：結果由兩位有經驗的病理醫師閱片后，取得一致意見得出，且所有指標只看腫瘤細胞，以腫瘤周圍正常腦組織為內對照。免疫組化染色結果以細胞膜、質、核中分別存在粗細一致的棕黃色顆粒為陽性。TOPⅡ陽性為核表達，每張切片計數所有TOPⅡ陽性細胞數/腫瘤細胞總數，為TOPⅡ的百分比，采用染色判定標準：陽性腫瘤細胞數≥5%為表達“+”。

4.統計學方法：應用SPSS 22.0統計學軟件對數據進行統計分析，采用χ2檢驗分析TOPⅡ在不同級別腦膠質瘤中表達差異，TOPⅡ與不同分級膠質瘤的關聯性用Spearman等級相關分析法檢驗，χ2檢驗探討TOPⅡ表達與臨床特征之間的關系，影響膠質瘤預后因素用COX回歸分析,以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.TOPⅡ在81例不同病理分級膠質瘤中的分布：TOPⅡ在膠質瘤組織中染色定位主要于細胞核(圖1)，81例膠質瘤標本中表達陽性有56例，其表達率占69.14%。在選取的81例腦膠質瘤標本中，TOPⅡ表達陽性在病理級別Ⅱ級、Ⅲ級和Ⅳ級所占比例分別為25.00%、87.50%和94.59%，其表達陽性率隨著腫瘤病理級別的增高呈現出上升的趨勢,χ2檢驗分析，TOPⅡ在Ⅱ級、Ⅲ級和Ⅳ級膠質瘤中分布比較，差異有統計學意義(P<0.05)，表明TOPⅡ表達與膠質瘤分級有關。經χ2檢驗分析，TOPⅡ表達在膠質瘤病理級別Ⅱ和Ⅲ級、Ⅱ和Ⅳ級之間比較，差異均有統計學意義(P<0.001)，詳見表1。

圖1 TOPⅡ在膠質瘤中表達(Envision法，×400)

表1 TOPⅡ表達與81例腦膠質瘤患者各項臨床因素的比較[n(%)]

2.TOPⅡ表達與81例不同病理分級膠質瘤的關聯性：采用Spearman秩相關分析法分析TOPⅡ表達與不同病理分級膠質瘤的相關性，TOPⅡ表達在81例不同病理分級腫瘤中呈正相關(r=0.644，P=0.000)。

3.TOPⅡ表達與81例腦膠質瘤臨床病理特征的相關性：TOPⅡ表達與各項臨床因素之間的關系，按照年齡、性別、病理分級、高低病理級別、術前KPS評分、IDH1表達，進行分組分析，分析結果詳見表1，在所選的81例腦膠質瘤患者，年齡>45歲的TOPⅡ陽性表達率為81.36%，年齡≤45歲陽性表達率為36.36%；男性患者中陽性表達率為72.73%，女性患者中陽性表達率為64.86%；其中28例低級別膠質瘤患者中TOPⅡ陽性表達7例(25%)，53例高級別膠質瘤患者中陽性表達49例(92.45%)；62例術前KPS評分≥80分患者中TOPⅡ陽性表達37例(59.68%)，19例術前KPS評分<80分患者中陽性表達19例(100%)；30例IDH1表達陽性患者中TOPⅡ陽性表達10例(33.33%)，51例IDH1表達陰性患者中TOPⅡ陽性表達46例(90.20%)，經χ2檢驗分析表明，年齡>45歲、高病理分級、術前KPS評分<80分、IDH1陰性表達者中TOPⅡ陽性表達率分別高于年齡≤45歲、低病理分級、術前KPS評分≥80分、IDH1陽性表達者(P<0.05)，而性別比較差異無統計學意義(P=0.445)。

4.81例腦膠質瘤預后影響因素的COX回歸分析：患者出院后，每隔5個月對患者或其家屬進行定期隨訪，隨訪截止時間為2020年8月。依據年齡、性別、病理級別高低、術前KPS評分、術后是否行輔助治療、TOPⅡ表達、IDH1表達分組，結果顯示，病理級別、術前KPS評分、術后輔助治療、TOPⅡ表達和IDH1表達對81例膠質瘤患者術后生存期限影響較大(P<0.05)，而年齡、性別對術后生存期影響較小(P>0.05)，詳見表2。

表2 影響81例膠質瘤術后生存期的COX回顧分析

討 論

膠質瘤是最常見的腦腫瘤類型，惡性膠質瘤具有極高的致死性，患者的5年生存率不到10%[7]。膠質瘤包括源于星形膠質細胞、室管膜細胞和少突膠質細胞或脈絡叢的腫瘤，其中星形細胞瘤是最常見的。星形細胞瘤，起源于星形細胞，可以是局限性或彌漫性的。局限性星形細胞瘤包括毛細胞性星形細胞瘤、多形性黃色星形細胞瘤和室管膜下巨細胞星形細胞瘤。彌漫性星形細胞瘤包括低級纖維星形細胞瘤、間變性星形細胞瘤、腦膠質瘤病和多形性膠質母細胞瘤[8]。膠質瘤是成人腦腫瘤中預后較差的一種[9]。腦膠質瘤也是所有兒科實體瘤中最常見和最致命的。迄今為止，腦部惡性腫瘤的治療始終是人類醫學史上的一個重大挑戰，這在很大程度上是由于這些癌癥的生物學特性導致的。然而，腦膠質瘤的發生、進展、具體侵襲機制尚不是完全清楚。但有研究發現，膠質瘤的發生、進展是一個極其繁雜的經過，涉及多種途徑及因素，其中包含多個細胞因子及癌癥基因的共同作用，其中一些具有診斷及影響預后的作用[10]。近年來，隨著分子生物學、分子遺傳學的發展及分子診斷、免疫組化等技術的興起，有關腫瘤增殖、診斷和預后的分子標志物逐漸被發現，如拓撲異構酶Ⅱ等。

拓撲異構酶是種同源二聚體蛋白，在復制、轉錄、重組、修復和染色質重塑過程中調節DNA螺旋的上旋或下旋[11,12]。這些酶通過提供短暫的DNA斷裂來執行拓撲轉換，通過該斷裂可以解決由于DNA螺旋的展開和重繞而導致的DNA糾纏的獨特問題[13]。根據它們是否在DNA中造成瞬時單鏈或雙鏈斷裂，分為Ⅰ和Ⅱ兩類[14]。目前TOPⅡ在人體細胞內是普遍存在的酶，在許多基本的DNA過程中發揮重要作用。它們通過在雙螺旋的糖磷酸主鏈上產生短暫的斷裂來消除遺傳物質中的結和纏結。由于Ⅱ型拓撲異構酶在其催化循環中產生DNA鏈斷裂是必不可少的，所以它們在每次起作用時都有可能產生基因組斷裂。因此，這些酶對增殖細胞的生存至關重要。

根據研究報道，TOPⅡ在膠質瘤中呈高表達，不同病理級別腦膠質瘤細胞中表達陽性率不同,隨著病理級別的升高而升高[15]。研究表明，TOPⅡ表達與男女性別因素無關，與高低病理分級有關，在高病理分級腦癌中的表達要顯著高于低病理分級的腦癌，同時認為TOPⅡ可作為人腦膠質瘤的增殖指數[16]。通過檢測TOPⅡ在腦膠質瘤細胞中的表達情況發現，TOPⅡ的表達與腦癌病理分級有關，提示TOPⅡ能作為評價膠質瘤生存的相關指標[6]。本研究結果表明，男女性別差異對TOPⅡ表達影響較小，年齡、病理分級和術前KPS評分對TOPⅡ表達影響較大；TOPⅡ在膠質瘤組織中陽性表達率為69.14%，在病理級別Ⅱ級、Ⅲ級和Ⅳ級所占比例分別為25.00%、87.50%和94.59%，其表達強度隨著腫瘤惡性程度的升高而升高，在低度與高度惡性組之間的表達水平也有較大差異；TOPⅡ表達與腫瘤惡性程度呈正相關，且與膠質瘤預后有關，可見TOPⅡ與膠質瘤患者病情及預后呈正相關，提示TOPⅡ表達可能通過某種未知的機制促使膠質瘤進一步惡性轉化，同時可作為評價膠質瘤惡性程度及預后的重要指標之一。

分析TOPⅡ表達預后不良的原因，可能與細胞增殖活化有關。通常來說，腫瘤增殖活化與生存有著緊密聯系，增生能力越強，其病理分級越高，生存期也越短。TOPⅡ是DNA復制、轉錄和細胞生長必需的，在增殖迅速的腫瘤中活性升高，提示其與腫瘤的增殖能力有關。研究顯示，TOPⅡ在細胞周期的S期、G2期、M期、部分G0期和G1期均有表達，且與Ki-67表達有較高的關聯性，Ki-67作為一種增殖抗原，具有體現腫瘤增殖潛能水平的能力，故認為TOPⅡ可作為人腦膠質瘤的增殖指數[17]。此外，有研究指出，TOPⅡ家族通過調節靶基因和參與能量代謝介導腫瘤細胞缺氧耐受而促進靶基因蛋白survivin表達，進而提高腫瘤侵襲性[18]。這與本研究結果大致相符，然而具體機制尚需開展深入的基礎研究予以證實。

綜上所述，TOPⅡ在膠質瘤中呈高表達，在不同級別膠質瘤中分布不同，提示與病理分級及預后相關，且TOPⅡ表達與年齡、病理級別、術前KPS評分和IDH1表達有關，因此，臨床可通過檢測TOPⅡ的表達，實現對膠質瘤患者病情嚴重程度及預后的評估。